野生柑橘響應(yīng)韌皮部桿菌亞洲種侵染的生物學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究.pdf

1、柑橘黃龍病（Citrus Huanglongbing，HLB）是當(dāng)前世界柑橘產(chǎn)業(yè)的頭號殺手。該病能侵染幾乎所有的柑橘栽培品種，目前尚無有效治愈手段。其病原暫定于α-變型菌綱（Proteobacteria）、韌皮桿菌屬（Liberibacter），是一種韌皮部專性寄生的難培養(yǎng)革蘭氏陰性細(xì)菌，根據(jù)16S rDNA序列不同可將其分為三個(gè)種：亞洲種（‘Candidatus Liberibacter asiaticus’, Las）、非洲種（‘C

2、a. Liberibacter africanus’, Laf）、美洲種（‘Ca. Liberibacter americanus’, Lam），其中Las分布最廣，且危害最大。迄今，在柑橘栽培種中尚未發(fā)現(xiàn)黃龍病抗性基因，嚴(yán)重制約了抗性育種的進(jìn)程。有研究表明，馬蜂柑（Citrus hystrix）對黃龍病具有一定的耐病性，但其耐病機(jī)制尚不清楚。中國是世界柑橘的重要起源中心，有著豐富的野生柑橘資源，而這些野生資源對黃龍病的抗感性缺乏系統(tǒng)研

3、究。因此，本研究以馬蜂柑、宜昌橙（C. ichangensis）、道縣野橘（C. daoxianensis）等野生柑橘資源為研究材料，以甜橙（C. sinensis）為敏感對照品種，接種毒源后進(jìn)行生物學(xué)癥狀觀察，并利用定量多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Quantitative Polymerase Chain Reaction, qPCR）定期檢測Las在不同寄主中的含量變化；同時(shí)對其進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組分析，以期從轉(zhuǎn)錄水平上解析野生柑橘和甜橙對Las的應(yīng)

4、答機(jī)制差異，為抗/耐黃龍病常規(guī)和轉(zhuǎn)基因育種提供新思路。所獲得的主要研究結(jié)果如下：
　　1.通過毒源嫁接和qPCR定期檢測，結(jié)果表明，野生柑橘和甜橙均在接種約90 d能檢測到Las。進(jìn)一步比較宜昌橙、道縣野橘和甜橙中病原菌含量的變化，發(fā)現(xiàn)從接種約120 d開始，Las在甜橙中的含量遠(yuǎn)高于宜昌橙和道縣野橘，初步表明Las在甜橙中的增殖速度高于野生柑橘；癥狀觀察發(fā)現(xiàn)，馬蜂柑和宜昌橙幾乎不顯癥，道縣野橘部分葉片出現(xiàn)輕微黃化，而甜橙感染黃龍

5、病后表現(xiàn)出明顯的葉片變小、黃化的現(xiàn)象，表明馬蜂柑和宜昌橙對黃龍病具有潛在的耐病性。
　　2.對感染初期的耐病品種馬蜂柑和感病品種甜橙進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序，篩選出耐病相關(guān)的差異表達(dá)基因并進(jìn)行了qPCR驗(yàn)證。結(jié)果表明，甜橙感染Las后共有604個(gè)基因差異表達(dá)，其中254個(gè)上調(diào)，350個(gè)下調(diào)，而馬蜂柑感染Las后共252個(gè)基因差異表達(dá)，其中179個(gè)上調(diào)，73個(gè)下調(diào)，染病馬蜂柑與染病甜橙相比共有4651個(gè)基因差異表達(dá)，其中2137個(gè)上調(diào)，25

6、14個(gè)下調(diào)。Las誘導(dǎo)的代謝途徑涉及糖代謝、光合作用、細(xì)胞壁代謝、次生物質(zhì)代謝、PR-蛋白（Pathogenesis Related Protein）、氧化還原反應(yīng)等。值得注意的是，與健康對照相比，染病甜橙中編碼淀粉合成酶（glgA）的兩個(gè)基因上調(diào)表達(dá)4倍以上，與淀粉分解有關(guān)的β-淀粉酶（BAM）基因下調(diào)表達(dá)，而它們在染病馬蜂柑中表達(dá)無顯著差異。染病馬蜂柑中大部分與細(xì)胞壁和次生產(chǎn)物代謝途徑相關(guān)的基因上調(diào)表達(dá)，而甜橙中該途徑相關(guān)基因大部分

7、下調(diào)表達(dá)。另外，多個(gè)與植物抗病相關(guān)的PR-蛋白相關(guān)基因被Las誘導(dǎo)差異表達(dá)，部分抗病蛋白相關(guān)基因的表達(dá)水平較敏感品種更高。RT-qPCR驗(yàn)證結(jié)果表明，在挑選的20個(gè)差異表達(dá)基因中，18個(gè)基因的驗(yàn)證結(jié)果與RNA-seq測序結(jié)果的變化趨勢基本保持一致，表明了RNA-seq具有較高的可靠性和準(zhǔn)確性。
　　3.對宜昌橙、道縣野橘和甜橙進(jìn)行了感病后期的轉(zhuǎn)錄組測序，結(jié)果顯示，宜昌橙、道縣野橘和甜橙接種Las約240 d分別有592、987和2

8、844個(gè)基因差異表達(dá)，與其接種Las后的顯癥程度呈現(xiàn)出一致性。Las侵染后期，與致病相關(guān)的淀粉合成、PP2蛋白相關(guān)基因在甜橙和道縣野橘中均上調(diào)表達(dá)，尤其是甜橙，但在宜昌橙中沒有明顯變化，推測可能是宜昌橙不顯癥的主要原因。同時(shí)，次生產(chǎn)物代謝途徑在3個(gè)品種中被激活，纖維素合成相關(guān)基因在宜昌橙和道縣野橘中上調(diào)表達(dá)，但在甜橙中下調(diào)表達(dá)；甜橙中大量PR-蛋白相關(guān)基因表達(dá)被抑制，而宜昌橙和道縣野橘相對較少；部分抗病蛋白基因在野生柑橘品種中表達(dá)水平較

9、高。
　　4.不同野生柑橘品種對Las侵染的應(yīng)答反應(yīng)存在一定的相似性，尤其是馬蜂柑和宜昌橙。4個(gè)柑橘品種感染黃龍病后，與植物防御相關(guān)的代謝途徑中大量差異表達(dá)基因均被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。然而，3個(gè)野生柑橘品種中均有部分抗病蛋白相關(guān)基因的表達(dá)水平較甜橙更高，在一定程度上增強(qiáng)了耐病性。此外，道縣野橘中淀粉代謝、PP2蛋白相關(guān)基因的表達(dá)雖上調(diào)但不及甜橙顯著，推測這可能是道縣野橘染病后出現(xiàn)輕微黃化的主要原因，而馬蜂柑和宜昌橙中該類基因均未被誘導(dǎo)差