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1、本試驗(yàn)分別做了以下探討,并取得了預(yù)期的結(jié)果:(1)利用牛性別決定基因(SRY)和牛Y染色體特有重復(fù)序列(BRY4a、BRY1、MSRD)作為雄性特異性基因,ZFX/ZFY基因作為內(nèi)部對(duì)照基因,分別進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增,以便用于牛早期胚胎性別鑒定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,這四個(gè)引物組合建立的擴(kuò)增體系均可用于性別鑒定。通過PCR反應(yīng)條件的反復(fù)摸索和研究,最終確定適合生產(chǎn)實(shí)踐的牛早期胚胎性別鑒定的基因是牛Y染色體特異性序列BRY基因。(2)改變引物濃度、
2、模板DNA的濃度、退火溫度、調(diào)整循環(huán)條件等影響PCR因素,確定適合生產(chǎn)實(shí)踐的PCR反應(yīng)體系為:反應(yīng)體系25μL,10×Buffer2.5μL,dNTP 0.5μL,TaqDNA聚合酶0.5μL,ddH2O 19.5μL,ZFX/ZFY上、下游引物各0.5μL,BRY4a上、下游引物各0.2μL,模板0.6μL。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性4min,94℃變性30s,54℃退火30s,72℃延伸1min,共28個(gè)循環(huán),72℃延伸10min,4℃
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