人CYP2E1野生型及CYP2E1-2、CYP2E1-3和CYP2E1-4突變體重組酶的表達及其代謝活性研究.pdf

1、本課題通過使用桿狀病毒-昆蟲表達系統(tǒng)異源表達了人CYP2E1野生型蛋白及CYP2E1*2、CYP2E1*3和CYP2E1*4三個有氨基酸變化的突變體蛋白。 為藥物Ⅰ相代謝的研究提供了單一性的酶源，同時也將CYP2E1野生型蛋白與突變體之間的代謝動力學參數(shù)進行對比。 目的： 表達CYP2E1野生型蛋白及CYP2E1*2、CYP2E1*3和CYP2E1*4三個突變體蛋白，比較它們之間的代謝動力學差異，同時為藥物Ⅰ相代

2、謝的研究提供單一性的酶源。 方法： 以人肝組織RNA為模板進行RT-PCR擴增反應，獲得CYP2E1基因的cDNA序列，然后通過定點突變獲得三個突變體的cDNA序列。將這些基因分別連接至pGEM-T載體上并進行DNA測序，選取正確序列的CYP2E1野生型及三個突變型基因，與pFastBac質粒連接，得到的重組質粒轉化入大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細胞中，經(jīng)過轉座作用，產(chǎn)生重組粘粒DNA(Bacmid-CYP2E1s)。該

3、重組粘粒轉染Sf9細胞后，即產(chǎn)生重組桿狀病毒。 將構建好的CYP2E1病毒，與本實驗室已構建好的CYPOR、CYPb5病毒一起加入Sf9細胞中共表達這三種蛋白以獲得有代謝活性的重組酶。通過測定共表達方法中三種病毒間不同的比例、不同的細胞感染復數(shù)值，以及不同的表達時間等條件下的活性，選取最佳表達條件。 以氯唑沙宗和7-甲氧基-4-三氟甲基香豆素作為底物，分別檢測重組酶的活性，并比較CYP2E1野生型與突變體之間的代謝動力學

4、參數(shù)。 結果: 對構建各CYP2E1s重組病毒的每個步驟的鑒定，表明本實驗成功構建了含有正確目的基因序列的各重組CYP2E1s病毒。將各重組CYP2E1s病毒分別感染Sf9細胞，通過RT-PCR實驗表明目的基因在mRNA水平上有表達； 通過westernblot實驗表明目的蛋白在蛋白水平有表達。 以氯唑沙宗和7-甲氧基-4-三氟甲基香豆素為底物，分別對重組酶的代謝活性進行檢測，表明構建的CYP2E1野生型

5、及CYP2E1*2、CYP2E1*3和CYP2E1*4突變體重組酶都有代謝活性，它們對氯唑沙宗的代謝動力學參數(shù)Km分別為72.4、40.83、37.16和32.66μmol·L-1，Vmax分別為0.402、0.374、0.356和0.354μmol·min-1·g-1protein；對7-甲氧基-4-三氟甲基香豆素的代謝動力學參數(shù)Km分別為35.3、10.6、19.2和14.22μmol·L-1，Vmax分別為0.023、0.034、