草魚（Ctenopharyngodon idellus）CYP2E1誘導體外模型研究.pdf

1、CYP2E1屬于藥物代謝酶P450家族，主要參與小分子量外來化學物的代謝活化，包括大量的強親電子物和前致癌物，在環(huán)境污染檢測中有重要應用。本文制備草魚肝微粒體和原代肝細胞，研究了草魚肝微粒體、原代肝細胞和肝細胞系中CYP2E1的活性狀況；以乙醇為誘導劑研究了不同體系對乙醇誘導的劑量效應和時間效應，并對劑量效應關系進行擬合。 CYP酶代謝是藥物生物轉化的主要途徑，其數(shù)量和活性大小直接影響藥物在體內的活化與代謝。本文對草魚肝微粒體C

2、YP酶含量及其活性進行了初步研究，以差速離心法提取草魚肝微粒體，以CO還原差示光譜法測得CYP酶及細胞色素b5含量分別為0.619±0.102 nmol/mg，0.264±0.042 nmol/mg。以7-乙氧異吩噁唑酮-O-脫乙基反應、苯胺-4-羥化反應、氨基比林-N-脫甲基反應作為CYP1A、CYP2E、CYP3A的探針反應，測得CYPIA酶活為O.043±0.004 nmol/mg/min,CYP2E1酶活為0.028±0.002

3、 nmol/mg/min，CYP3A酶活為0.207±0.035 nmol/mg/min。結果表明草魚肝微粒體中CYP酶發(fā)育完好，并且具有參與藥物代謝的3種主要亞型活性，其含量與活性大小與其它實驗動物相差較大。本實驗的方法與結果為草魚CYP酶的系統(tǒng)研究提供可靠手段，最終為指導水產(chǎn)合理用藥提供理論依據(jù)。 原代肝細胞基本維持了肝臟的代謝功能，特別是很好的保留了與體內一致的細胞色素P450酶的水平，是體外藥物試驗的理想模型和分析手段。

4、以消化法制備草魚原代肝細胞，在6h內新鮮分離的肝細胞CYP2E1活性為(0.031±0.003)(nmol/min·mg)，與體內情況一致。原代細胞對乙醇的耐受能力較弱，乙醇濃度10～40mmol/L，LDH的滲出量與乙醇濃度呈正相關，乙醇濃度為80～160 mmol/L，細胞發(fā)生嚴重的死亡脫落。原代肝細胞暴露于10mmol/L的乙醇0～24h，CYP2E1活性和LDH滲出量均呈上升趨勢，表明10mmol/L乙醇依然會對原代肝細胞造成一

5、定的損傷。 以乙醇為細胞色素P450 2E1的誘導劑，在草魚肝細胞L8824、GCL細胞中研究了該誘導劑與酶活性之間的時間效應關系和劑量效應關系，試驗以CHSE-1細胞為對照。細胞傳代后培養(yǎng)48h，加入含有不同濃度乙醇的新鮮培養(yǎng)基，孵育誘導24h，加入底物苯胺反應30min。以苯胺的代謝產(chǎn)物4-氨基酚的生成量來反映CYP2E1活性。CHSE-1細胞試驗表明苯胺濃度為10～16mmol/L時CYP2E1活性最大，可達(0.152±

6、0.095)nmol/min·mg，該濃度范圍的苯胺適合用于指示CYP2E1的活性。以Gentox模型對誘導的劑量效應進行擬合，得到三個先升高后降低的曲線，說明乙醇對CHSE-1、L8824和GCL細胞中CYP2E1有先誘導后抑制作用。擬合方程為F(x)=(PO+kx)/(1+(x/EC<,50>)<'nH>)參數(shù)P<,0>分別為0.140，0.275，0.142；nH分別為2.456，2.319，2.106；k分別為為0.024，0.