多種環(huán)境化學(xué)物經(jīng)人CYP2E1代謝活化作用研究.pdf

1、目前研究己知PCBs的羥化作用是導(dǎo)致其獲得致突變性的重要步驟，而這一步反應(yīng)依賴于CYPs酶系的作用，但具體由哪個(gè)CYPs亞型催化尚不清楚。有研究顯示，二惡英類似PCBs(DL-PCBs)能夠通過(guò)芳烴受體(AHR)的持續(xù)激活高效誘導(dǎo)CYP1家族蛋白表達(dá)，CYP1A1、1A2等為這類PCBs的潛在代謝酶，但目前還缺乏其介導(dǎo)PCBs遺傳毒性的報(bào)告。在本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)人CYP2E1可以活化多個(gè)非二惡英類似PCBs(NDL-PCBs)為致突

2、變物。但其他CYPs亞型是否參與PCBs的代謝活化、其活化作用強(qiáng)度，及其與CYPE1相比對(duì)PCBs作用有何結(jié)構(gòu)選擇性尚不清楚。因此需要一種表達(dá)多種CYP亞型的模型來(lái)觀察。L-02細(xì)胞為人正常肝細(xì)胞系，已報(bào)道它具有人CYP1A1、1A2、1B1、2E1、3A4等CYPs亞型的內(nèi)源性表達(dá)。
　　目的：
　　本研究擬采用既往在重組V79細(xì)胞系觀察到具有依賴于人CYP2E1的強(qiáng)致突變性的PCBs和L-02細(xì)胞進(jìn)行微核試驗(yàn)，觀察選擇性

3、CYP2E1抑制劑對(duì)PCBs以及依賴于其它CYPs代謝活化的間接致突變物誘發(fā)微核效應(yīng)的影響，以此探索各種CYPs對(duì)受試PCBs代謝活化作用的相對(duì)強(qiáng)度。同時(shí)構(gòu)建表達(dá)人CYP1A1的V79衍生細(xì)胞，以它作為與通過(guò)AHR途徑誘導(dǎo)的CYPs酶系的代表來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證以L-02細(xì)胞為模型的發(fā)現(xiàn)。
　　苯是經(jīng)典的間接致突變物，其在人類生活以及工業(yè)中廣泛存在與應(yīng)用。早在1982年己由國(guó)際癌癥研究署(IARC)確定為環(huán)境致癌物。以往認(rèn)為苯在進(jìn)入人體后

4、，于肝臟中由CYP2E1代謝成苯酚、氫醌，之后這些中間產(chǎn)物經(jīng)血液進(jìn)入骨髓由髓過(guò)氧化物酶活化為苯醌，引起致突變效應(yīng)并最終導(dǎo)致白血病的發(fā)生。與苯（最簡(jiǎn)單的芳香族化合物）不同，1-甲基芘是烷基化多環(huán)芳烴的典型代表，其通過(guò)各種人類活動(dòng)如吸煙、汽車尾氣以及熏制食品產(chǎn)生。盡管通過(guò)生化試驗(yàn)以及細(xì)菌致突變?cè)囼?yàn)已發(fā)現(xiàn)1-甲基芘能由多種CYP酶亞型活化為1-羥甲基芘，再經(jīng)SULT酶活化為終毒物1-磺基甲基芘，但是這些實(shí)驗(yàn)僅通過(guò)合成的中間代謝物1-羥甲基芘來(lái)

5、觀察，尚缺乏哺乳動(dòng)物細(xì)胞相關(guān)的毒性研究。本課題組前期研究通過(guò)微核試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，人CYP2E1具有持續(xù)活化苯成為醌類終毒物的能力。同時(shí)用微核試驗(yàn)與次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（Hprt）位點(diǎn)致突變?cè)囼?yàn)觀察到1-甲基芘經(jīng)過(guò)I相和II相代謝酶連續(xù)活化引起遺傳毒性效應(yīng)。但是它們?cè)诩?xì)胞毒性方面數(shù)據(jù)有待完善，本次研究采用MTT或CCK-8試驗(yàn)檢測(cè)苯及其羥化代謝物、1-甲基芘以及1-羥甲基芘對(duì)V79-hCYP2E1-SULT1A1誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性強(qiáng)度。

6、　　方法：
　　1.采用CCK-8試驗(yàn)分析2，3，3’-三氯聯(lián)苯(PCB20)和2，3，4’-三氯聯(lián)苯(PCB22)對(duì)L-02細(xì)胞生存/生長(zhǎng)的影響，每組設(shè)6個(gè)重復(fù)測(cè)試。根據(jù)細(xì)胞毒性決定微核試驗(yàn)的濃度范圍（細(xì)胞存活率60％以上），觀察L-02細(xì)胞暴露于PCB20與PCB22后微核細(xì)胞發(fā)生頻率。同時(shí)觀察CYP2E1選擇性抑制劑反式1，2-二氯乙烯(DCE)以及二甲亞砜(DMSO)共培養(yǎng)對(duì)微核形成的影響。CYP2E1抑制條件(DMSO2

7、％，v∶v)下，L-02細(xì)胞中其他CYPs亞型(CYP1A1、1B1、1A2以及3A4)的特異性代謝活化能力以苯并(a)芘和黃曲霉毒素B1(AFB1)誘導(dǎo)微核形成來(lái)反映。每個(gè)濃度組設(shè)計(jì)3個(gè)重復(fù)測(cè)試。
　　2.采用編碼野生型人CYP1A1基因的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染V79細(xì)胞，經(jīng)抗生素篩選，并通過(guò)蛋白免疫印跡與CYP1A1依賴性間接致突變物誘發(fā)微核，鑒定所表達(dá)的酶蛋白的免疫原性和酶活性，從而構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)人CYP1A1的重組V79細(xì)胞系（V

8、79-hCYP1A1）。在此基礎(chǔ)上，采用CCK-8試驗(yàn)和微核試驗(yàn)觀察PCB52，74，77及81分別對(duì)V79-hCYP2E1與V79-hCYP1A1細(xì)胞的細(xì)胞毒性和遺傳毒作用。細(xì)胞暴露于受試化合物12h后繼續(xù)培養(yǎng)12h，每個(gè)濃度組CCK-8試驗(yàn)重復(fù)6個(gè)測(cè)試，微核試驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)重復(fù)測(cè)試。
　　3.采用MTT法或CCK-8法分析苯及其羥化代謝物、1-甲基芘以及1-羥甲基芘對(duì)V79-hCYP2E1-hSULT1A1細(xì)胞（V79細(xì)胞衍生細(xì)胞

9、，重組表達(dá)人CYP2E1與人SULT1A1）生存/生長(zhǎng)的影響。CYP2E1與SULT1A1酶在這些細(xì)胞毒效應(yīng)中的作用（代謝活化或解毒），則依據(jù)其特異抑制劑1-氨基苯并三唑與五氯苯酚共培養(yǎng)對(duì)細(xì)胞存活/生長(zhǎng)的影響來(lái)判斷。每組設(shè)置6個(gè)重復(fù)測(cè)試。
　　4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析MTT、CCK-8與微核試驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，通過(guò)方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。
　　結(jié)果：
　　1.PCB20與PCB22等化

10、合物誘發(fā)L-02微核的效應(yīng)以及人CYP2E1抑制劑的影響
　　PCB20和PCB22都在10μmol/L以上濃度引起一定的細(xì)胞毒性，但細(xì)胞生存率均高于70％。在加入了DCE(1000μmol/L)后，細(xì)胞毒性略有減弱。PCB20與PCB22均誘發(fā)L-02細(xì)胞微核形成，且呈明顯的濃度-效應(yīng)關(guān)系。而DCE共培養(yǎng)可阻斷兩種PCBs誘發(fā)微核的效應(yīng)。DMSO可抑制PCB22誘發(fā)L-02細(xì)胞微核的作用，表現(xiàn)為1.6％(v∶v)濃度時(shí)呈現(xiàn)完全抑

11、制（印證DMSO抑制人CYP2E1活性）;而DMSO保持2％(v∶v)時(shí)，B(a)P和AFB1卻仍然誘導(dǎo)L-02細(xì)胞微核形成并呈現(xiàn)明顯的濃度-效應(yīng)關(guān)系，提示PCBs對(duì)L-02細(xì)胞的遺傳毒效應(yīng)主要依賴于人CYP2E1的活性，而另外幾個(gè)CYPs亞型沒(méi)有明顯的作用。
　　2.穩(wěn)定表達(dá)人CYPlA1的V79細(xì)胞系的構(gòu)建與PCB52，74，77及81對(duì)V79-hCYP2E1和V79-hCYP1A1誘發(fā)微核的作用。
　　與V79對(duì)照細(xì)胞

12、不同，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染（含人CYP1A1的cDNA的）真核表達(dá)載體的細(xì)胞能夠在含博來(lái)霉素(300 mg/L)的選擇性培養(yǎng)液生長(zhǎng)并形成集落(集落形成率為25.3％)。對(duì)單克隆化的抗生素抵抗細(xì)胞進(jìn)行的蛋白免疫印跡試驗(yàn)，觀察到其具有人CYP1A1蛋白表達(dá)，而未轉(zhuǎn)染的V79細(xì)胞則無(wú)表達(dá)。并且CYP1A1依賴性間接致突變物苯并(a)芘（10μmol/L）對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞誘發(fā)微核形成，而對(duì)V79對(duì)照細(xì)胞則無(wú)作用。結(jié)合蛋白表達(dá)和CYP1A1酶依賴性遺傳毒效應(yīng)，可判

13、斷已成功構(gòu)建V79-hCYP1A1細(xì)胞。
　　各受試PCBs對(duì)V79-hCYP1A1細(xì)胞的微核試驗(yàn)顯示，PCB74，77以及81僅能在40μmol/L（最高測(cè)試濃度）誘發(fā)微核細(xì)胞率升高，而PCB52則無(wú)作用。在V79-hCYP2E1細(xì)胞，PCB52，74，81均能誘發(fā)微核細(xì)胞率增高;其中PCB74和PCB81于20μmol/L即能明顯誘導(dǎo)V79-hCYP2E1細(xì)胞微核形成。PCB77對(duì)V79-hCYP2E1細(xì)胞無(wú)明顯作用。

14、　　3.苯及其羥化代謝物誘導(dǎo)V79-hCYP2E1-hSULT1A1細(xì)胞毒性作用苯、苯酚在受試濃度（10～300μmol/L）未顯示細(xì)胞毒性;1，2，4-三羥基苯于320μmol/L濃度明顯降低細(xì)胞存活/生長(zhǎng)水平;氫醌、兒茶酚以及苯醌均在20μmol/L出現(xiàn)了細(xì)胞存活率降低。CYP酶抑制劑ABT（60μmol/L）可抑制氫醌的細(xì)胞毒性，表現(xiàn)為氫醌在20μmol/L濃度的細(xì)胞毒性阻斷。ABT對(duì)兒茶酚的細(xì)胞毒性的抑制作用更加明顯，表現(xiàn)為AB

15、T增加各兒茶酚濃度組細(xì)胞存活率。這些結(jié)果以細(xì)胞毒作用為試驗(yàn)終點(diǎn)提示人CYP2E1可繼續(xù)活化氫醌和兒茶酚為細(xì)胞毒性更強(qiáng)的代謝物。
　　4.1-甲基芘與1-羥甲基芘誘導(dǎo)V79-hCYP2E1-hSULT1A1細(xì)胞毒性作用
　　1-甲基芘于微核試驗(yàn)相應(yīng)的暴露條件下，對(duì)V79細(xì)胞與V79-hCYP2El-hSULT1A1細(xì)胞都未顯示明顯的細(xì)胞毒性;然而在5μmol/L濃度對(duì)兩種細(xì)胞均呈現(xiàn)低劑量興奮效應(yīng)（hormesis，即細(xì)胞生長(zhǎng)增

16、強(qiáng)），而且在V79-hCYP2E1-hSULT1A1細(xì)胞該作用不受任一酶抑制劑共培養(yǎng)的影響，提示這個(gè)低劑量興奮效應(yīng)不依賴于代謝活化。1-羥甲基芘在則在基因突變?cè)囼?yàn)的暴露條件下，于0.5Lmol/L和1μmol/L濃度時(shí)對(duì)V79-hCYP2E1-hSULT1A1細(xì)胞（而非V79細(xì)胞）產(chǎn)生低劑量興奮效應(yīng)，且該效應(yīng)可由PCP阻斷，提示這樣的低劑量興奮效應(yīng)是由終毒物引起。這兩種情況下低劑量興奮效應(yīng)的差異尚有待進(jìn)一步研究作解釋。綜合所觀察到的結(jié)果

17、，1-MP和1-HMP用于微核試驗(yàn)及基因突變?cè)囼?yàn)的濃度建議為2-20μmol/L和0.5-4μmol/L。
　　結(jié)論：
　　1.PCB20與PCB22能夠在內(nèi)源性表達(dá)的CYP2E1作用下誘發(fā)微核。人CYP1A1、人CYP1A2、人CYP1B1與人CYP3A4對(duì)于這兩種PCBs的代謝活化無(wú)明顯作用。本研究首次在人類細(xì)胞中觀察到多氯聯(lián)苯誘發(fā)染色體改變的作用。
　　2.人CYP2E1主要參與NDL-PCBs的活化，對(duì)四氯聯(lián)苯