鉤端螺旋體比較基因組研究.pdf

1、在親緣性較近的細菌中,那些只存在于致病菌而不存在于非致病菌的基因往往具有重要的生物學(xué)意義.本實驗通過抑制消減雜交技術(shù),以致病性問號鉤端螺旋體賴株為tester,非致病性雙曲鉤端螺旋體57001株為driver,比較致病與非致病鉤端螺旋體之間基因組的差異,從而篩選出致病鉤端螺旋體特有的基因片段.經(jīng)兩輪消減雜交和PCR后,獲得的消減混合物克隆入pMD18-T載體中建立消減雜交文庫.經(jīng)dot blot篩選鑒定陽性克隆,并進行測序及同源分析.用

2、PCR方法驗證所得的基因為問號鉤端螺旋體賴株所特有,而在雙曲鉤端螺旋體57001株中不存在.用dot blot方法鑒定上述基因在不同致病和非致病鉤端螺旋體中分布的情況.結(jié)果顯示在隨機挑取的188個克隆中,有24個克隆含有tester株特異的基因序列,其中5個克隆含有的序列為非編碼區(qū),剩下的19個克隆含有23個不同的蛋白編碼序列.在這23個蛋白編碼序列中,1個編碼亮氨酸富含序列家族蛋白,1個編碼外膜蛋白, 9個編碼與代謝和物質(zhì)轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白

3、,其余12個編碼功能未知蛋白.經(jīng)dot blot檢測發(fā)現(xiàn)上述23個賴株特異基因存在于賴株及其他大部分致病性鉤端螺旋體中,不存在于非致病性鉤端螺旋體中. Ⅰ本部分研究結(jié)果顯示抑制消減雜交技術(shù)是在兩株鉤端螺旋體間篩選特異基因的有效方法,篩選到的一些賴株特異基因可能與毒力有關(guān).進一步探討這些基因的生物學(xué)功能將對鉤端螺旋體的致病機制的研究提供重要信息。 Ⅱ利用DNA芯片檢測不同問號鉤端螺旋體基因組差異鉤端螺旋體病為人獸共患病并呈

4、全球分布,人通過接觸污染鉤端螺旋體的水源或土壤而感染.問號鉤端螺旋體賴型和哥本哈根型全基因組測序的完成使我們能以此為基礎(chǔ)制備基因組DNA芯片,并用比較基因組雜交(CGH)的方法來分析問號鉤端螺旋體基因組差異.本研究中所用的芯片含有賴株3528個開放閱讀框架(ORF),應(yīng)用該芯片我們檢測到有275個基因在11個檢測菌中至少有一株菌中缺失,問號鉤端螺旋體中約有2917個核心基因.芯片雜交結(jié)果顯示,編碼基礎(chǔ)細胞功能的基因如復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯相關(guān)

5、基因較保守.賴株特異基因主要包括那些編碼細胞表面結(jié)構(gòu)基因、碳水化合物轉(zhuǎn)運和代謝相關(guān)基因.同時,利用芯片雜交技術(shù)和生物信息學(xué)方法在賴株中發(fā)現(xiàn)了2個基因島(GI),這兩個基因島中含有大量賴株特異基因,這些基因可能與問號鉤端螺旋體賴株強致病性有關(guān).芯片結(jié)果還顯示,不同血清群鉤端螺旋體的0抗原合成相關(guān)基因存在不同,可以此為基礎(chǔ)發(fā)展并研制快速分型技術(shù).上述賴株特異性基因為深入研究問號鉤端螺旋體的致病機制以及研制新型的鉤端螺旋體病診斷方法或鉤端螺旋