丙酸-維生素B12耦合發(fā)酵工藝集成及代謝產(chǎn)物組分控制.pdf

1、丙酸桿菌屬菌株發(fā)酵過程中不僅會產(chǎn)生以丙酸為主的有機酸，還會產(chǎn)生維生素B12，但是傳統(tǒng)的發(fā)酵過程往往只收獲一種產(chǎn)品。為了提高發(fā)酵的過程經(jīng)濟性，本論文建立了一種以膜分離和離子交換樹脂原位吸附為特征的新型生物反應(yīng)過程，實現(xiàn)了丙酸/維生素B12的雙產(chǎn)物耦合發(fā)酵；通過優(yōu)化培養(yǎng)基中的碳源組分來調(diào)節(jié)代謝產(chǎn)物中的雜酸組分，提高了底物對丙酸的轉(zhuǎn)化效率。
　　本論文的主要研究成果如下：
　　一．為解決費氏丙酸桿菌批次發(fā)酵過程中前體物質(zhì)5,6-二

2、甲基苯并咪唑(DMB)對發(fā)酵的不利影響及丙酸的反饋抑制作用，建立了“邊發(fā)酵、邊分離、邊轉(zhuǎn)化”的半連續(xù)耦合發(fā)酵工藝，實現(xiàn)了丙酸/維生素B12的聯(lián)產(chǎn)。
　　（1）在膜在線分離菌體的基礎(chǔ)上，引入陰離子層析技術(shù)原位吸附分離發(fā)酵液中的丙酸，解除了丙酸的反饋抑制作用。結(jié)果表明，經(jīng)過一次弱堿性陰離子交換樹脂ZGD630吸附分離后，丙酸的產(chǎn)量可達到57.55 g/L，丙酸產(chǎn)率為0.34 g/(L.h)，糖酸轉(zhuǎn)化率為0.61 g/g，較批次發(fā)酵分別

3、提高了24.54％、21.43%、19.61%。
　　（2）綜合考慮發(fā)酵罐容積、ZGD630樹脂吸附載量、膜通量等因素，構(gòu)建了一套10L規(guī)模的丙酸/維生素B12雙產(chǎn)物耦合發(fā)酵系統(tǒng)，建立了維生素B12的細胞離位轉(zhuǎn)化工藝。結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵進行至84h時，在膜在線分離菌體的基礎(chǔ)上，向移除丙酸的發(fā)酵清液中接入新鮮的種子液繼續(xù)發(fā)酵84h，加入0.9 mg/L的DMB進行維生素B12的后續(xù)轉(zhuǎn)化，發(fā)酵結(jié)束時維生素B12產(chǎn)量為28.36 mg/L

4、，較批次發(fā)酵提高了18.26%；丙酸產(chǎn)量為59.75 g/L，提高了33.73%。
　?。?）利用雙產(chǎn)物耦合發(fā)酵系統(tǒng)連續(xù)運轉(zhuǎn)5個循環(huán)后，丙酸產(chǎn)量累計達到122.47g/L，維生素B12的產(chǎn)量累計為54.81 mg/L，該過程僅需504h，相當(dāng)于3個批次發(fā)酵時間，設(shè)備的利用效率得到了顯著提高，體現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。
　　二．為了有效控制發(fā)酵液中雜酸（丁二酸、乳酸等）的比例，提高碳源對丙酸的轉(zhuǎn)化效率，以產(chǎn)酸丙酸桿菌為實驗菌株，優(yōu)

5、化了培養(yǎng)基中的碳源組分及濃度、pH調(diào)節(jié)方式，提高了丙酸的產(chǎn)量。
　　（1）比較分析了以葡萄糖、甘油為單一碳源及二者混合使用（不同比例）時，發(fā)酵液中丙酸、丁二酸、乳酸、乙酸的含量及比例。結(jié)果表明，以葡萄糖和甘油為單一碳源時，丙酸產(chǎn)量分別為45.58 g/L和48.52 g/L，而丁二酸的產(chǎn)量分別為26.08 g/L和10.29 g/L，而以甘油進行流加補料發(fā)酵時，乳酸產(chǎn)量先升高后下降，說明碳源濃度不同影響雜酸的產(chǎn)生。因此，可通過調(diào)節(jié)

6、甘油和葡萄糖的比例來控制發(fā)酵液中的雜酸比例。
　?。?）優(yōu)化了培養(yǎng)基中甘油和葡萄糖的比例，提高了丙酸的產(chǎn)量。結(jié)果表明，當(dāng)甘油和葡萄糖濃度分別為20g/L和80g/L（1:4）時，丙酸產(chǎn)量為54.75 g/L，提高了20.12%；丁二酸產(chǎn)量為8.49 g/L，降低了67.45%，糖酸轉(zhuǎn)化率為0.57 g/g，提高了18.75%。
　?。?）采用分段補加的方式，使發(fā)酵液中的甘油濃度維持在5 g/L以下，結(jié)果表明，該發(fā)酵條件下，丙