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文檔簡介
1、背景:
癲癇是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病,其特點(diǎn)是神經(jīng)元的異常興奮和同步化放電。癲癇持續(xù)狀態(tài)(Status epilepticus,SE)時死亡率高達(dá)20%。慢性癲癇長期反復(fù)發(fā)作也可引起不可逆的神經(jīng)功能損害,導(dǎo)致遺留嚴(yán)重的認(rèn)知功能損害和行為改變。雖然臨床已有多種抗癲癇藥物,但對于難治性癲癇的療效仍然有限,需要進(jìn)一步尋找新的治療靶點(diǎn)。
5-羥色胺(Serotonin,5-HT)是一種腦內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì),與抑制癲癇活動密切相
2、關(guān)。5-HT受體在腦內(nèi)共有超過14種亞型,其中5-HT1A受體與癲癇關(guān)系最為密切[2-4]。目前5-HT1A受體在急性和慢性癲癇動物模型中究竟是抑制還是促進(jìn)癲癇作用仍存在一定的爭議。這種截然相反的作用可能和各個癲癇模型的機(jī)制不同相關(guān)。pilocarpine模型相比KA模型更能全面模擬SE過程中的各種特性和長時間SE發(fā)作所帶來的嚴(yán)重?fù)p害。而杏仁核慢性電點(diǎn)燃模型能較好模擬慢性顳葉癲癇發(fā)生過程,因此采用該兩種模型來研究5-HT1A受體在急性和
3、慢性癲癇過程中的作用,能提供更好的科學(xué)價值。
5-HT1A受體在腦內(nèi)分布廣泛,主要分布在腦干、額葉皮層、邊緣系統(tǒng)等區(qū)域。目前尚不清楚究竟是哪些部位的5-HT1A受體參與了對SE和癲癇形成的作用。有報道海馬富含5-HT1A受體且在癲癇發(fā)生發(fā)展過程中非常重要。5-HT1A受體在顳葉癲癇患者和慢性動物模型中致癇灶、邊緣系統(tǒng)區(qū)域密度下降[4,6],可能參與了癲癇的發(fā)生和發(fā)作機(jī)制。研究各部位5-HT1A受體在癲癇過程中的動態(tài)變化可能有助
4、于明確5-HT1A受體的作用機(jī)制。但目前尚無在SE模型和慢性杏仁核模型中干預(yù)的研究,因此本研究擬通過皮下和海馬局部干預(yù),明確5-HT1A受體對Li-pilocarpine所致SE和杏仁核慢性點(diǎn)燃模型癲癇的作用,觀察海馬5-HT1A受體是否參與其中,為癲癇的治療尋求新的靶點(diǎn)。
目前對5-HT1A受體表達(dá)變化的研究多為針對慢性癲癇形成的過程,而對急性SE過程中5-HT1A受體的變化未見有報道。細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶(Extracellua
5、rsignal-regulated kinase,ERK)參與MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[7]。已知5-HT1A受體激活在正常大鼠中能抑制ERK激活。而ERK通路在SE過程中激活后,能與下游的電壓依賴性鉀離子通道蛋白Kv4.2結(jié)合,抑制Kv4.2在CA1區(qū)神經(jīng)元突觸體和細(xì)胞膜上表達(dá)及超極化電流的形成,表現(xiàn)為促進(jìn)癲癇形成的作用[8-12]。因此,本研究擬觀察海馬和腦干5-HT1A受體在Li-pilocarpine模型SE過程中的表達(dá)變化及Li-
6、pilocarpine模型中激活5-HT1A受體后對ERK通路活化的作用,分析5-HT1A受體的相關(guān)作用機(jī)制。
第一部分5-HT1A受體對大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)的作用目的:
通過皮下和海馬局部注射5-HT1A受體激動劑或拮抗劑,觀察5-HT1A受體對Li-pilocarpine大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)發(fā)作的作用。
方法:
1.280-300 g SD大鼠手術(shù)植入顱骨電極,術(shù)后休息7-10天,按照體重配對分為7個
7、實驗組,分別在pilocarpine注射前1小時給予皮下注射以下試劑:組1:磷酸鹽緩沖液(PBS)1 mL/kg;組2:激動劑8-OH-DPAT0.01mg/kg;組3:8-OH-DPAT0.1 mg/kg;組4:8-OH-DPAT0.5 mg/kg;組5:8-OH-DPAT1.0mg/kg;組6:拮抗劑WAY-1006351.0mg/kg,組7:激動劑8-OH-DPAT0.01mg/kg注射后即刻給予拮抗劑WAY-1006351.0m
8、g/kg。
2.大鼠給予LiCl3meq/kg,22-24h后給予腹腔注射pilocarpine。記錄行為學(xué)發(fā)作GS潛伏期、GS持續(xù)時間,腦電圖上首次癇樣放電、SE潛伏期及總放電時間。腦電記錄從pilocarpine注射前半小時到后2小時為止。
3.雙側(cè)海馬干預(yù)大鼠給予手術(shù)植入顱骨電和微量注射導(dǎo)管(AP:-3.5 mm,L:±2.5 mm,V:-2.9mm)。術(shù)后休息7-10天。體重配對分為8-OH-DPAT組和PB
9、S組,在pilocarpine注射前15min分別給予8-OH-DPAT1μg(1μL)和PBS1μL。其余Li-pilocarpine模型建立和腦電、行為學(xué)觀察同前。
結(jié)果:
1.腹腔給予激動劑各組癲癇持續(xù)狀態(tài)的發(fā)生率和急性死亡率未發(fā)現(xiàn)存在顯著性差異。
2.行為學(xué)觀察激動劑8-OH-DPAT0.5 mg/kg和1.0 mg/kg組的GS發(fā)作潛伏期顯著增高,而GS發(fā)作累計持續(xù)時間較PBS組顯著降低,且1.0
10、 mg/kg組作用效果優(yōu)于0.5 mg/kg組。
3.激動劑8-OH-DPAT0.5 mg/kg和1.0 mg/kg組的首次癇樣放電和SE起始潛伏期顯著增高,總放電時間較PBS組顯著降低,且1.0 mg/kg組作用效果優(yōu)于0.5 mg/kg組。
4.低劑量(0.01 mg/kg和0.1 mg/kg)8-OH-DPAT對行為學(xué)和腦電發(fā)作均無抑制作用。
5.激動劑8-OH-DPAT1.0 mg/kg組的抑制作用
11、能被拮抗劑WAY-100635有效抑制,但單純注射拮抗劑對發(fā)作無影響。
6.海馬干預(yù)中,8-OH-DPAT組GS持續(xù)時間較PBS組下降,但對GS和腦電圖上放電潛伏期無作用。
結(jié)論:
1.5-HT1A受體激活對Li-pilocarpine模型癲癇持續(xù)狀態(tài)形成和發(fā)作有抑制作用。
2.皮下注射低劑量激動劑0.01和0.1 mg/kg對Li-pilocarpine模型癲癇發(fā)作無影響。
3.雙側(cè)海
12、馬內(nèi)5-HT1A受體激活能抑制Li-pilocarpine模型癲癇持續(xù)狀態(tài)發(fā)作的嚴(yán)重程度,但不影響癲癇持續(xù)狀態(tài)形成過程。
第二部分5-HT1A受體對杏仁核點(diǎn)燃癲癇形成的作用目的:
通過腹腔和海馬局部給予5-HT1A受體激動劑或拮抗劑,觀察5-HT1A受體對杏仁核點(diǎn)燃過程癲癇形成的作用。
方法:
1.280-300g SD大鼠給予手術(shù)植入基底旁杏仁核電極,術(shù)后休息7-10天。大鼠測定初始后放電閾值(
13、ADT)后,每天給予大鼠1次電流刺激,刺激強(qiáng)度為ADT,共刺激16天。記錄大鼠發(fā)作等級、后放電時程(ADD)等參數(shù)。
2.皮下給藥大鼠按體重配對分為6個實驗組,分別在每天電刺激前1小時皮下注射以下試劑:組1:磷酸鹽緩沖液(PBS)1mL/kg;組2:激動劑8-OH-DPAT0.01mg/kg;組3:8-OH-DPAT0.1 mg/kg;組4:8-OH-DPAT0.5 mg/kg;組5:8-OH-DPAT1.0 mg/kg;組6
14、:激動劑8-OH-DPAT0.01mg/kg注射后即刻給予拮抗劑WAY-1006351.0mg/kg。
3.海馬局部干預(yù)大鼠在手術(shù)時右側(cè)海馬植入微量注射導(dǎo)管(AP:-3.5 mm,L:-2.5 mm,V:-2.9mm),分為8-OH-DPAT組和PBS組,在每天點(diǎn)燃前15min分別給予8-OH-DPAT1μg(1μL)和PBS1μL。其余同前。
結(jié)果:
1.皮下注射激動劑8-OH-DPAT1.0 mg/kg
15、和0.5 mg/kg組顯著延緩杏仁核點(diǎn)燃過程發(fā)作等級的增加,1.0 mg/kg組同時縮短每天點(diǎn)燃的ADD,而且這種作用能被同時注射拮抗劑WAY-1006351.0 mg/kg抑制。
2.激動劑8-OH-DPAT1.0 mg/kg組停留在1級的天數(shù)長于PBS組,停留在5級的天數(shù)短于PBS組。同時,達(dá)到2、3、4、5級所需要的刺激數(shù)均多于PBS組。0.5 mg/kg組存在類似作用趨勢,但統(tǒng)計無顯著性差異。激動劑1.0 mg/kg組
16、比PBS組在部分性階段(1-3級)停留更長的時間,而在全面性階段(4-5級)停留時間更短,且該作用能被拮抗劑有效抑制。
3.激動劑加拮抗劑組停留在4級的天數(shù)長于激動劑1.0 mg/kg組,而到達(dá)2、3、4、5級的天數(shù)明顯短于激動劑1.0 mg/kg組,其中到達(dá)3級和4級的天數(shù)兩組間存在顯著性差異。
4.低劑量激動劑0.1和0.01 mg/kg組對發(fā)作等級和ADD各指標(biāo)均無影響。
5.海馬局部干預(yù)與PBS組相
17、比對點(diǎn)燃過程發(fā)作等級和ADD各指標(biāo)均無影響。
結(jié)論
1.皮下注射5-HT1A受體激動劑8-OH-DPAT1.0 mg/kg延緩杏仁核模型點(diǎn)燃進(jìn)程,對慢性顳葉癲癇形成具有抑制作用,且這種作用在部分性癲癇階段最明顯。
2.皮下注射低劑量激動劑0.01和0.1 mg/kg對杏仁核模型癲癇形成無影響。
3.海馬5-HT1A受體不參與對慢性癲癇形成的抑制作用。
第三部分癲癇持續(xù)狀態(tài)中5-HT1A受
18、體表達(dá)水平的動態(tài)變化及ERK通路的研究目的:
明確腦干和海馬5-HT1A受體在Li-pilocarpine模型SE過程中的表達(dá)變化,并觀察5-HT1A受體激活后對SE過程中ERK通路活化的作用。
方法:
1.250-300g SD大鼠建立Li-pilocarpine模型。在pilocarpine給藥后0小時,1小時,2小時,6小時和24小時留取海馬和腦干的石蠟切片標(biāo)本和蛋白組織標(biāo)本,分別用于對5-HT1A受
19、體的免疫組化和Western blot檢測。
2.經(jīng)微波修復(fù)后,進(jìn)行免疫組化染色。切片在顯微鏡下拍照后將圖片導(dǎo)入Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件,測算陽性細(xì)胞數(shù)、陽性面積和平均光密度值。
3.通過Western blot方法半定量檢測5-HT1A受體在各時間點(diǎn)的表達(dá)變化。
4.用于ERK通路研究的大鼠根據(jù)體重配比分為4組,組1:空白對照組:在給予氯化鋰后24小時,給予磷酸鹽緩沖液(PBS)1m
20、L/kg替代pilocarpine注射;組2:單純Li-pilocarpine模型組;組3:皮下激動劑干預(yù)組:建立Li-pilocarpine模型,并在pilocarpine注射前1小時皮下注射激動劑8-OH-DAPT1.0 mg/kg;組4:皮下激動劑合并拮抗劑干預(yù)組:建立Li-pilocarpine模型,并在pilocarpine注射前1小時前皮下激動劑8-OH-DPAT0.01mg/kg注射后即刻給予拮抗劑WAY-1006351.
21、0mg/kg注射。分別在pilocarpine給藥后0小時,1小時,2小時,6小時和24小時留取海馬蛋白標(biāo)本。
4.通過Western blot方法半定量檢測pERK1/2和ERK1/2在各時間點(diǎn)的表達(dá)變化。
結(jié)果:
1.腦干5-HT1A受體主要表達(dá)在中縫背核(DRN)和中央上核(MRN),分布在5-HT神經(jīng)元細(xì)胞膜上,少部分在胞漿中可見。5-HT1A受體在pilocarpine注射后1小時表達(dá)增加,但進(jìn)入
22、SE晚期(6小時和24小時)表達(dá)減少。其中DRN受體變化的幅度大于MRN。
2.海馬5-HT1A受體分布在CA1區(qū),CA3區(qū)和DG區(qū)的錐體細(xì)胞和顆粒細(xì)胞膜上,但表達(dá)濃度不高。海馬受體在pilocarpine注射后2小時表達(dá)增多,但在SE晚期期(6小時和24小時)表達(dá)下降。
3.Li-pilocarpine模型組pERK/ERK值顯著高于空白對照組。其中以pERK2變化為主,在整個SE過程中持續(xù)增高。而pERK1僅在S
23、E晚期升高明顯。激動劑使pERK1/ERK1和pERK2/ERK2在SE過程各時間點(diǎn)均較低,而合并拮抗劑組該作用消失。
結(jié)論:
1.腦干中縫核區(qū)5-HT1A受體表達(dá)在pilocarpine注射后1小時升高,SE后期表達(dá)下降。DRN受體密度變化程度大于MRN。
2.海馬5-HT1A受體在pilocarpine注射后2小時表達(dá)增高,后期表達(dá)明顯減少。5-HT1A受體表達(dá)改變與神經(jīng)元密度變化不完全相關(guān)。
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