不同處理油松cDNa-SRAP PCR體系建立及基因表達差異分析.pdf

1、本研究以河北省承德市平泉縣不同林分油松林為研究對象，通過野外試驗處理和室內(nèi)分子實驗分析，設(shè)置對照處理，每株10頭油松毛蟲（Dendrolimus tabulaeformis）取食處理，每株30頭油松毛蟲取食處理和剪葉處理（剪葉處理程度與30頭油松毛蟲取食處理相同），結(jié)合cDNA-SRAP的基因表達差異研究方法，初步研究了自然條件下不同林分油松在不同處理條件下的基因表達差異，分析產(chǎn)生差異的原因，以及差異表達基因的功能進行分析，為進一步確認

2、油松在自然環(huán)境下林分類型和油松毛蟲取食的共同作用下產(chǎn)生誘導(dǎo)抗性的結(jié)構(gòu)機制研究提供基因?qū)用娴淖C據(jù)。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)利用正交試驗設(shè)計L16(45)對PCR反應(yīng)體系的TaqDNA聚合酶、模板cDNA、引物、Mg2+、dNTP這五個因素在四個水平上進行優(yōu)化。使用SPSS軟件對PCR結(jié)果結(jié)合方差分析和直觀分析。確定了可用于油松研究的cDNA-SRAP最優(yōu)的擴增反應(yīng)體系(20μL):Taq酶2.0U，CDNA模板用量80～120

3、 ng，引物濃度0.4μmol/L，Mg2+濃度1.5 mmol/L，dNTP濃度0.2 mmol/L，2μL00×Taq Buffer，用ddH2O補足。反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性50 s，35℃退火50 s，72℃延伸1 min，5個循環(huán);94℃變性50 s，將退火溫度升為50℃退火50 s，72℃延伸0 min，35個循環(huán);最后，72℃延伸10 min;4℃保存。
　　(2)利用優(yōu)化后的cDNA-SRAP技

4、術(shù)，對225對SRAP引物進行篩選，從中選取20對引物組合進行統(tǒng)計，共擴增的到油松基因表達差異條帶256條，基因表達差異條帶92條。純林擴增出118條，其中包含差異表達片段45條;混交林擴增出138條，其中包含差異表達片段47條。10頭油松毛蟲取食處理共得到基因表達差異24條，30頭油松毛蟲取食處理共得到基因表達差異條帶37條，剪葉處理共得到基因表達差異條帶31條。結(jié)果顯示，產(chǎn)生的基因表達類型主要是上調(diào)表達型和下調(diào)表達型;不同林分類型中

5、的油松基因表達差異不明顯;不同處理對油松的基因有著明顯的誘導(dǎo)作用，并且誘導(dǎo)作用隨著脅迫處理的強度增加而增強，增強的效果使得某些基因表達增強。機械損傷也可以誘導(dǎo)油松產(chǎn)生基因表達差異，但作用強度弱于相同強度的油松毛蟲取食。
　　(3)對10個差異表達轉(zhuǎn)錄衍生片段進行了測序，根據(jù)其堿基序列在NCBI網(wǎng)站上進行了Blast-X的比對，其中四個片段找到了相應(yīng)的同源蛋白。分別是TDF-1、TDF-2、TDF-4、TDF-8，長度分別為253