轉(zhuǎn)移癌和其原發(fā)癌的比較研究及其在腫瘤轉(zhuǎn)移預測和治療的意義.pdf

1、轉(zhuǎn)移癌和其原發(fā)癌的比較研究及其在腫瘤轉(zhuǎn)移預測和治療的意義
　　 一.研究背景和研究目的
　　 轉(zhuǎn)移是導致癌癥患者死亡的根本因為,目前尚無有效的措施可以阻止轉(zhuǎn)移。闡明癌癥轉(zhuǎn)移的機制是干預或控制腫瘤轉(zhuǎn)移的基礎,目前對于腫瘤轉(zhuǎn)移認識有不同的學說,但是這些學說尚不能解釋全部腫瘤轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象?，F(xiàn)代生物技術(shù)和納米制藥技術(shù)的進步為發(fā)現(xiàn)新的抗腫瘤轉(zhuǎn)移的靶點和實現(xiàn)藥物商品化提供了可能,但是現(xiàn)有對腫瘤轉(zhuǎn)移的認識是建立在細胞和動物實驗基礎上,很

2、少有開展原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移腫瘤的配對比較研究的。研究同一病人原發(fā)癌和轉(zhuǎn)移癌為加深認識腫瘤轉(zhuǎn)移的機制、發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點提供了可能。已有文獻開展的對原發(fā)癌和轉(zhuǎn)移癌的研究則主要集中在乳腺癌和結(jié)腸癌,而對肺癌報道的文獻僅占少部分,并且主要集中在EGFR和其調(diào)節(jié)通路上。
　　 肺癌是世界上發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一,就診時70％左右的患者已處于中晚期,即使手術(shù)切除后患者2年內(nèi)也多死于復發(fā)或轉(zhuǎn)移,研究肺癌轉(zhuǎn)移有望解決肺癌目前治療困境。乳腺癌轉(zhuǎn)移機

3、制研究比較深入,現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些關鍵的基因有可能成為新的抗轉(zhuǎn)移的靶點,由于這些關鍵基因和分子在癌癥中普遍發(fā)揮重要作用,這為研究肺癌轉(zhuǎn)移機制提供了研究基礎。分子靶向治療是目前癌癥治療的組成部分,但是分子靶向治療的療效與其分子表達狀態(tài)有關,比較肺癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶分子狀態(tài)的異同性可以為臨床醫(yī)生在選擇分子靶向治療時提供參考意見。肺癌肺內(nèi)轉(zhuǎn)移和肺多原發(fā)癌一直是困擾臨床醫(yī)生的主要難題,由于多原發(fā)肺癌和肺內(nèi)轉(zhuǎn)移預后不同,比較原發(fā)和轉(zhuǎn)移首先是確定的肺癌

4、轉(zhuǎn)移灶,因此區(qū)分肺內(nèi)原發(fā)和轉(zhuǎn)移是進行肺癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶比較研究的基礎。一些關鍵分子蛋白的表達與肺癌的轉(zhuǎn)移和預后密切相關,癌基因EGFR已經(jīng)作為分子靶點用于治療肺癌,血管生成因子VEGF抑制劑正在進行臨床試驗,MET、HIF-1α、TGF-β1是癌癥潛在的治療靶點。但是對于這些基因的研究在肺癌主要集中在原發(fā)腫瘤的研究,在肺癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮怎樣的作用還沒有文獻報告。p53作為肺癌的關鍵抑癌基因,其突變和多態(tài)性和肺癌易感性密切相關,有研究者通過p

5、53基因突變鑒別肺內(nèi)原發(fā)和轉(zhuǎn)移,其理論基礎是建立在p53基因突變發(fā)生在腫瘤轉(zhuǎn)移之前,轉(zhuǎn)移和原發(fā)灶有共同的克隆來源和分子基礎,一致的為肺內(nèi)轉(zhuǎn)移,不一致的為肺內(nèi)原發(fā),但是其他研究者在乳腺癌和結(jié)腸癌研究p53基因突變在原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶存在一定的差異。這就使得需要尋找更好的鑒別肺內(nèi)原發(fā)和轉(zhuǎn)移的工具。單核苷酸多態(tài)性(SNP)是第三代基因多態(tài)性,是更好地反映個體遺傳差異的分子標記,在腫瘤研究中有廣泛用途,p53的72密碼子SNP與肺癌個體易感性已有相

6、關研究,本課題意在比較原發(fā)肺癌和其轉(zhuǎn)移癌的p53的72密碼子SNP狀態(tài)并且探討作為鑒別肺內(nèi)原發(fā)和肺內(nèi)轉(zhuǎn)移的可能性。
　　 因此,本課題研究目的是:
　　 1.比較肺癌原發(fā)和轉(zhuǎn)移的腫瘤干細胞標記物CD133、血管生成因子VEGF、缺氧誘導因子HIF-α、在器官選擇性轉(zhuǎn)移發(fā)揮重要作用的TGF-β1、參與腫瘤微環(huán)境的腫瘤壞死因子TNF-α、抑癌基因p53、間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化因子MET和參與腫瘤特異性轉(zhuǎn)移的COX2的蛋白的表達,為認識

7、肺癌轉(zhuǎn)移機制、豐富和發(fā)展腫瘤轉(zhuǎn)移學說、預測肺癌轉(zhuǎn)移、發(fā)現(xiàn)可能的抗肺癌轉(zhuǎn)移的靶點奠定研究基礎。
　　 2.通過p53的72密碼子SNP鑒別肺內(nèi)原發(fā)和肺內(nèi)轉(zhuǎn)移,研究p53的72密碼子的多態(tài)性作為鑒別肺癌肺內(nèi)原發(fā)和轉(zhuǎn)移的工具的可能性。
　　 二.臨床資料和方法
　　 在病理庫中收集2002年-2009年期間在山東省立醫(yī)院住院的原發(fā)肺癌和轉(zhuǎn)移肺癌均切除的石蠟標本,共有11例為確認的肺癌原發(fā)和轉(zhuǎn)移,3例其轉(zhuǎn)移灶從現(xiàn)有標準不

8、能確認是肺內(nèi)原發(fā)和轉(zhuǎn)移,其中1例肺癌原發(fā)灶有2個石蠟標本。共收集29個石蠟標本進行下列實驗:
　　 1.常規(guī)HE染色:確認肺癌原發(fā)和轉(zhuǎn)移來自同一標本
　　 2.SP方法免疫組化實驗步驟按照說明書進行,并設陽性對照和陰性對照。
　　 3.提取石蠟標本中的DNA采用凱杰生物技術(shù)有限公司石蠟標本提取試劑盒,嚴格按照說明書操作。
　　 4.設計p53的72密碼子的多態(tài)性引物,提取的DNA樣本進行聚合酶連反應擴增,

9、反應產(chǎn)物進行限制酶內(nèi)切反應,圖像儀下觀察p53的72密碼子基因型。
　　 5.蛋白表達強度在原發(fā)癌和轉(zhuǎn)移癌的比較采用Marginal Homogeneity統(tǒng)計檢驗。
　　 三.結(jié)果
　　 1.臨床資料
　　 2.免疫組化結(jié)果
　　 3.DNA提取結(jié)果3個病例未能從對應的石蠟標本中提取出有效的DNA。11例23標本中DNA質(zhì)量在10ug-15ug之間,純度經(jīng)測定符合PCR反應標準
　　 4

10、.p53codon72 SNPg9例確認為轉(zhuǎn)移的8例一致,不一致的1例原發(fā)腫瘤為基因型純合子,腦轉(zhuǎn)移腫瘤為雜合子。另外3例不能確認是否轉(zhuǎn)移的,原發(fā)腫瘤一致的基因型一致,通過對照同一病例不同標本和原發(fā)轉(zhuǎn)移SNP的狀態(tài)確定這3例為轉(zhuǎn)移瘤。
　　 5.14例原發(fā)和轉(zhuǎn)移的功能蛋白表達COX2不一致的2例,P值=0.157；MET不一致3例,P值=0.564:VEGF不一致的3例,P值=0.083；HIF-1α不一致的2例,P值=0.18

11、0、TNFα不一致的1例,P值=0.317；p53表達不一致4例,P值=0.317,差異均未達到顯著性統(tǒng)計學意義,均大于0.05。
　　 四.結(jié)論
　　 1.肺癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶在病理分級方面存在一些差異,這種差異主要見于原發(fā)癌具有多種分化程度的,而轉(zhuǎn)移癌只有一種分化程度,沒有觀察到腫瘤演進過程中轉(zhuǎn)移分化程度降低,提示轉(zhuǎn)移癌和原發(fā)癌有共同的克隆來源。肺癌原發(fā)和轉(zhuǎn)移在功能蛋白表達具有一定的差異性,但無明顯統(tǒng)計學差異,原發(fā)癌和

12、轉(zhuǎn)移癌具有較高的一致性,提示轉(zhuǎn)移癌保持了原發(fā)癌的關鍵生物學特征。
　　 2.CD133是否可以作為肺癌干細胞的標記還需要進一步研究,VEGF、COX2原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶表達具有高度的相似性,在應用貝伐單抗和賽來昔布治療肺癌時如果不能獲得轉(zhuǎn)移癌組織可以通過原發(fā)癌的表達預測其抑制劑的療效。MET、HIF-1α是肺癌抗轉(zhuǎn)移潛在的有效靶點,TGF-β1和TNFα在腫瘤間質(zhì)和腫瘤細胞均有表達,是否可以作為抗轉(zhuǎn)移的靶點需要進一步研究。
　

13、　 3.p53的密碼子72的SNP是區(qū)分原發(fā)肺癌和肺內(nèi)轉(zhuǎn)移的有效工具,原發(fā)肺癌和肺內(nèi)轉(zhuǎn)移以及其他部位的轉(zhuǎn)移灶存在高度一致性,反映原發(fā)肺癌和轉(zhuǎn)移癌在遺傳背景上高度一致,但仍然有1例不一致,提示p53在轉(zhuǎn)移過程中可能發(fā)生了突變。
　　 4.轉(zhuǎn)移癌和原發(fā)癌在細胞形態(tài)和分級、功能蛋白表達和p53的72密碼子多態(tài)性的高度相似性,提示轉(zhuǎn)移癌和原發(fā)癌有共同的克隆來源,轉(zhuǎn)移癌保持了原發(fā)癌的關鍵生物學特征。而功能蛋白表達及p53 condon7