Bcl-2和CyclinE在肺癌發(fā)生及生物學(xué)行為中的作用.pdf

1、背景與目的: 肺癌是一種死亡率、發(fā)病率極高的惡性腫瘤。近年來(lái)許多國(guó)家對(duì)于肺癌的控制以及治療投入了巨大的財(cái)力物力，但是其發(fā)病率及死亡率仍然在不斷上升。2008年11月第八個(gè)“全球肺癌關(guān)注月”，世界衛(wèi)生組織年鑒表明：近幾年，肺癌以歐美國(guó)家高發(fā)，在據(jù)統(tǒng)計(jì)的50個(gè)國(guó)家和地區(qū)中，肺癌居惡性腫瘤首位的有36個(gè)國(guó)家和地區(qū)。而肺癌已成為中國(guó)的第一大癌，衛(wèi)生部公布的《2006年城鄉(xiāng)居民主要死亡原因》顯示，我國(guó)肺癌的調(diào)整發(fā)病率已高達(dá)61.4/10萬(wàn)

2、，更令人憂慮的是，肺癌發(fā)病率仍呈現(xiàn)著不斷攀升的趨勢(shì)，2015年，我國(guó)將成為世界第一肺癌大國(guó)。 肺癌在病理學(xué)上可分為鱗癌、腺癌、大細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌；按類型分為非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌。小細(xì)胞肺癌占全部的肺癌的12％～15％，小細(xì)胞肺癌是一種惡性程度很高的腫瘤，生長(zhǎng)迅速，容易早期全身轉(zhuǎn)移，而且小細(xì)胞肺癌是所有治療敏感的腫瘤中最難治愈的一種。 當(dāng)今社會(huì)生活中健康已成為人類的第一需求。人類為征服癌癥不斷地進(jìn)行著努力。隨著社會(huì)

3、的發(fā)展和科技的進(jìn)步，人類對(duì)機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育、遺傳與進(jìn)化、免疫防御、衰老死亡等生命現(xiàn)象的認(rèn)識(shí)有了突破性的進(jìn)展，而且人類在病毒與腫瘤、細(xì)胞分化與腫瘤、細(xì)胞周期與腫瘤、癌基因、抑癌基因、信號(hào)傳導(dǎo)與腫瘤和新生血管形成與腫瘤轉(zhuǎn)移等方面也取得進(jìn)展。目前，普遍認(rèn)為不可控制的細(xì)胞增生是惡性腫瘤的主要特征。腫瘤的惡性增生從生物學(xué)角度看主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面：一方面是腫瘤細(xì)胞的不滅性即凋亡障礙；另一方面是細(xì)胞分裂的失控即細(xì)胞周期網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)的障礙，這兩方面都是目

4、前分子腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)。 凋亡障礙常有癌基因和蛋白的參與。bcl—2(B—cell lymphoma—2)基因發(fā)現(xiàn)于t(14；18)染色體易位的B細(xì)胞淋巴瘤，與其他癌基因不同，bcl—2的作用是抑制細(xì)胞的凋亡而不是促進(jìn)細(xì)胞的增殖。Bcl—2蛋白通過(guò)抑制促凋亡蛋白Bax和Bak的活性，抑制細(xì)胞凋亡。因凋亡作用的減弱不能及時(shí)清除細(xì)胞周期紊亂和具有突變傾向的細(xì)胞，故抗凋亡蛋白的過(guò)度表達(dá)與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。研究顯示，多種腫瘤細(xì)胞中有B

5、cl—2蛋白的表達(dá)增加。 細(xì)胞周期調(diào)控異常不僅是腫瘤發(fā)生的重要前提，而且也是促進(jìn)腫瘤惡性增殖和轉(zhuǎn)移的重要因素。細(xì)胞周期有兩個(gè)重要的轉(zhuǎn)換點(diǎn)即G1/S和G2/M。在它們的轉(zhuǎn)換中都設(shè)有設(shè)有存在檢查點(diǎn)?？刂七@些檢查點(diǎn)即可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控。有一些學(xué)者認(rèn)為腫瘤發(fā)生的最根本的原因是這兩個(gè)檢查點(diǎn)的失控使得原本應(yīng)該停止增生的細(xì)胞或生理凋亡的細(xì)胞不停的進(jìn)入細(xì)胞周期因而導(dǎo)致細(xì)胞的惡性增生。腫瘤的發(fā)生是正常染色體多重?fù)p傷的復(fù)雜過(guò)程，其最終表現(xiàn)為細(xì)

6、胞周期調(diào)控機(jī)制的紊亂，分化受阻細(xì)胞表現(xiàn)為無(wú)限制自主的增生和分裂。細(xì)胞周期調(diào)控異常主要表現(xiàn)為細(xì)胞周期時(shí)相的變化和相關(guān)調(diào)控因子——細(xì)胞周期蛋白(cyclins)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDKs)及其抑制劑(CKIs)的表達(dá)異常。CyclinE屬于細(xì)胞周期G1期的正性調(diào)節(jié)因子，主要參與細(xì)胞周期G1/S期轉(zhuǎn)換的調(diào)控，并與其他調(diào)控因子cyclinD、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(Rb)、轉(zhuǎn)錄因子E2F、抑癌基因表達(dá)產(chǎn)物p53、Kip家族、CDK2、4、6

7、等相互作用決定細(xì)胞的生存與凋亡。cyclinE在細(xì)胞周期的G1晚期和S期表達(dá)，且在G1/S期達(dá)到峰值。CyclinE蛋白的過(guò)早及過(guò)高表達(dá)可加速細(xì)胞進(jìn)入S期，促進(jìn)細(xì)胞的增殖。CyclinE—CDK2復(fù)合物的作用被認(rèn)為是啟動(dòng)DNA復(fù)制及進(jìn)入S期的重要調(diào)節(jié)因素，而其作用與細(xì)胞中的cyclinE的表達(dá)水平及CDK2的激酶活性密切相關(guān)。G1期的縮短，減少了細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)因子的依賴性，從而有利于腫瘤的發(fā)生。在一些研究報(bào)道中，大多數(shù)腫瘤包括肝癌、鼻咽癌、

8、卵巢癌、乳腺癌及胰腺癌中都有cyclinE的過(guò)度表達(dá)，并且在卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌中，cyclinE還被認(rèn)為與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，并作為預(yù)示腫瘤發(fā)展的一項(xiàng)獨(dú)立指標(biāo)。 此外，cyclinE與腫瘤血管的生成和腫瘤的轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。有研究表明CyclinE可能是通過(guò)以下兩種可能的機(jī)制參與轉(zhuǎn)移：其一是cyclinE—CDK2復(fù)合物的靶蛋白參與細(xì)胞黏附的丟失，其表現(xiàn)為有絲分裂相關(guān)的細(xì)胞遷移性增加；其二，最新的研究證據(jù)表明，cyclinE基因的

9、過(guò)度表達(dá)影響了染色體的穩(wěn)定性。高水平表達(dá)的cyclinE蛋白影響S期進(jìn)程，可產(chǎn)生非整倍體細(xì)胞。在腎癌、胰腺癌、B—細(xì)胞淋巴瘤等腫瘤的研究中，已發(fā)生轉(zhuǎn)移病例的cyclinE蛋白的表達(dá)明顯高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的病例，并與腫瘤的病理、臨床分級(jí)相吻合，直接影響患者的預(yù)后。 目前在有關(guān)肺癌的研究中，對(duì)于Bcl—2蛋白的研究多集中于鱗癌、腺癌，小細(xì)胞肺癌及小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系的研究報(bào)道相對(duì)較少。有關(guān)CyclinE蛋白的研究多以消化道腫瘤和婦科腫瘤為主

10、，但CyclinE蛋白與肺癌發(fā)生和發(fā)展關(guān)系的研究少見(jiàn)。因此，本研究以大細(xì)胞和小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系做為研究對(duì)象，主要檢測(cè)Bcl—2蛋白和CyclinE蛋白在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)變化，并探討其在肺癌發(fā)生和發(fā)展中的作用及其與生物學(xué)行為之間的關(guān)系。 方法: 1.細(xì)胞培養(yǎng)，MRC—5細(xì)胞在含10％小牛血清的MEM培養(yǎng)液、H460和H446細(xì)胞在含10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液、在飽和濕度、在37℃、5％CO2孵箱中傳代培養(yǎng)。

11、 2.應(yīng)用Western—blot法檢測(cè)Bcl—2蛋白在MRC—5、H460和H446三種細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)差異。 3.以H460細(xì)胞系為標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)噻唑藍(lán)(MTT)比色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖情況，并繪制生長(zhǎng)曲線，篩選UV照射細(xì)胞的劑量和后續(xù)培養(yǎng)時(shí)間。 4.應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)MRC—5、H460和H446三種細(xì)胞在UV照射后不同培養(yǎng)時(shí)間下Bcl—2蛋白的表達(dá)差異。 5.應(yīng)用雙重胸腺嘧啶核苷(TdR)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行同步化處

12、理。 6.應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胸腺嘧啶核苷(TdR)誘導(dǎo)細(xì)胞同步化的效果。 7.應(yīng)用Western—blot法檢測(cè)同步化后MRC—5、H460和H446三種細(xì)胞內(nèi)CyclinE蛋白的表達(dá)差異。 結(jié)果: 1.Western—blot法檢測(cè)Bcl—2蛋白的表達(dá) Bcl—2蛋白在MRC—5、H460和H446三種細(xì)胞中的表達(dá)有明顯差別(P<0.01)，測(cè)得肺腫瘤細(xì)胞系H460和H446的Bcl—2蛋白表

13、達(dá)灰度值分別為MRC—5的6.10倍和4.60倍。 2.篩選UV照射的時(shí)間和劑量 (1)培養(yǎng)時(shí)間固定，UV照射劑量分別為20s、40s、60s和80s時(shí)，隨著照射劑量的增大，細(xì)胞的增殖明顯下降，并且80s照射劑量的細(xì)胞死亡較多。說(shuō)明UV照射對(duì)細(xì)胞的增殖抑制有劑量依賴性，但較大劑量可致細(xì)胞死亡。 (2)當(dāng)UV照射劑量固定(60s)，進(jìn)一步細(xì)化后續(xù)培養(yǎng)時(shí)間，發(fā)現(xiàn)在10.5小時(shí)時(shí)細(xì)胞增殖達(dá)最大抑制。 3.免疫組

14、化法檢測(cè)UV照射后細(xì)胞中Bcl—2蛋白的表達(dá) UV照射后，MRC—5、H460和H446三種細(xì)胞系中Bcl—2蛋白的表達(dá)水平均較未經(jīng)UV照射的細(xì)胞有明顯升高。隨著照射后培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，陽(yáng)性細(xì)胞的比例增加并且陽(yáng)性細(xì)胞的顏色加深，尤其是在培養(yǎng)10.5h后，那些已與周圍失去粘連作用的細(xì)胞均呈深棕色，提示Bcl—2蛋白的表達(dá)與照射后的培養(yǎng)時(shí)間正相關(guān)。 4.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞同步化結(jié)果 胸腺嘧啶核苷誘導(dǎo)的細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀

15、檢測(cè)的結(jié)果顯示，各組細(xì)胞80％以上處于G1期，10％左右處于S期，僅有一小部分細(xì)胞處于G2和M期，表明各組細(xì)胞已經(jīng)同步化于G1/S期。 5.蛋白印跡檢測(cè)結(jié)果 MRC—5、H460和H446三種細(xì)胞中CyclinE蛋白的表達(dá)水平有明顯差別(P<0.01)，肺腫瘤細(xì)胞系H460和H446CyclinE蛋白表達(dá)的灰度值分別是肺正常細(xì)胞MRC—5的10.59倍和5.72倍。 結(jié)論: 1.Bcl—2蛋白的過(guò)表達(dá)與