苦參堿對U937細胞增殖抑制和誘導凋亡作用研究.pdf

1、研究背景及目的：淋巴瘤是人類常見的惡性腫瘤，U937細胞是目前大量應用于基礎研究的淋巴瘤細胞株。淋巴瘤的治療仍以化療為主，主要藥物包括阿霉素、環(huán)磷酰胺、長春新堿和放線菌D等，因選擇性較差，毒副作用較大，對正常機體免疫與造血系統(tǒng)有較大的損害，長期大劑量應用受到限制。所以，尋找選擇性高和毒副作用小的藥物是目前提高臨床療效的重要途徑?？鄥A(Matrine，Mat，C<,15> H<,24>N<,20>)是豆科槐屬植物苦參或平科植物廣豆根中分

2、離出來的一種生物堿，盛產(chǎn)于我國西部地區(qū)。近年來，Mat體內(nèi)外抗腫瘤活性受到極大關注，有研究報道Mat對腫瘤細胞有抑制增殖和促進凋亡作用，但國內(nèi)外尚無Mat對U937細胞作用的相關研究。 本實驗擬①觀察Mat對體外培養(yǎng)的人組織淋巴瘤細胞U937及人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)的形態(tài)學變化、乳酸脫氫酶活性改變、細胞周期影響，探討Mat是否對L1937

3、細胞具有增殖抑制增殖抑制效應；②觀察Mat對HUVECs的毒副作用；③觀察Mat作用U937細胞后形態(tài)學改變、凋亡率及Bcl-2mRNA的表達變化，探討Mat對U937細胞凋亡作用的影響，并對其作用機制進行初步研究。 方法： 1．采用倒置顯微鏡、臺盼藍拒染法、四甲基偶氮唑鹽(MTT)法、細胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶活性測定、流式細胞術(shù)(FCM)，研究Mat體外對U937細胞和HUVECs增殖影響及其與細胞周期調(diào)控的關系。

4、 2．觀察經(jīng)Mat誘導后U937細胞形態(tài)學改變(包括核漿成熟情況、核漿比例、細胞直徑、細胞體積、細胞器及特殊物質(zhì)形成等)。 3．Annexin V-FITC雙染法顯示經(jīng)Mat誘導后U937細胞凋亡率。 4．瓊脂糖凝膠電泳法檢測經(jīng)Mat誘導后U937細胞凋亡的生物化學特征。 5．RT-PCR檢測經(jīng)Mat誘導后U937細胞Bcl-2基因表達情況。 結(jié)果： 1．Mat(0.2 mg/ml～1.0mg/

5、ml)作用1d、2d、3d、4d、5d后對U937細胞均有增殖抑制作用，在該濃度范圍內(nèi)呈劑量和時間依賴性，其半數(shù)抑制濃度為0.4mg/ml，有效作用時間為1d；Mat(0.1 mg/ml～1.0mg/ml)作用1d、2d、3d、4d、5d后對腫VECs無明顯增殖抑制作用，亦無劑量和時間依賴性； 2．Mat(0.2 mg/ml～1.0mg/ml)作用U937細胞48h后，S期細胞比例增加，細胞發(fā)生S期阻滯；對HUVECs細胞周期無

6、明顯影響； 3．0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml Mat均可使U937細胞核漿比例下降，染色質(zhì)邊集，出現(xiàn)凋亡小體，隨Mat濃度增加細胞形態(tài)學改變越明顯。 4．AnnexinV-FITC雙染法顯示Mat(0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml)作用U937細胞72h后細胞凋亡率分別為3.25％、5.32％、8.17％、

7、11.20％、16.05％、22.25％、28.58％，與U937細胞對照組(1.84％)及Mat 0.1mg/ml組(1.95％)比較差異有統(tǒng)計學意義；瓊脂糖凝膠電泳法(agarose gel electrophoresis，AGE)顯示0.3～1.0mg/ml Mat作用U937細胞72h后凋亡細胞可形成明顯的DNA梯度。 5．RT-PCR檢測結(jié)果顯示U937細胞經(jīng)Mat(0.2 mg/ml～1.0mg/ml)作用72h后B

8、cl-2 mRNA表達明顯減弱，隨劑量增加表達減弱越明顯。 結(jié)論： 1．Mat在一定濃度和時間對U937細胞具有增殖抑制作用，呈量-效和時-效依賴關系； 2．Mat對U937細胞具有細胞毒性作用，呈量-效和時-效依賴關系； 3．Mat能影響U937細胞的細胞周期分布，下調(diào)c-myc的表達，抑制腫瘤細胞增殖，促進細胞凋亡； 4．Mat在一定濃度和時間不能抑制HUVECs增殖，對其細胞周期亦無明顯影響