microRNA-376b-5p對(duì)腦缺血后血管新生的調(diào)控作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的:腦梗死是一類(lèi)發(fā)病率高、致殘率高以及復(fù)發(fā)率高的急性缺血性腦血管病，占全部腦卒中的60％-80％。缺血可以導(dǎo)致大量神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)不可逆的變性壞死，導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺損癥狀。促進(jìn)缺血區(qū)新生血管的形成增加新的側(cè)枝循環(huán)，可通過(guò)改善局部腦血流供應(yīng)，挽救缺血半暗帶內(nèi)瀕臨死亡的神經(jīng)細(xì)胞，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)，這對(duì)腦梗死有重要的治療作用。已有研究證明，腦缺血可誘導(dǎo)血管新生，而HIF-1-VEGF-NOTCH通路是缺血缺氧后調(diào)節(jié)血管新生的重要的信

2、號(hào)通路。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類(lèi)內(nèi)源性單鏈小分子RNA，參與了生物體的生長(zhǎng)發(fā)育、器官形成、細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)過(guò)程，與多種疾病密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，miR-376b-5p在腦缺血后缺血區(qū)腦組織內(nèi)表達(dá)降低，我們通過(guò)生物學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)HIF-1α與miR-376b-5p的序列存在配對(duì)關(guān)系，故我們推測(cè)miR-376b-5p可能參與了血管新生的調(diào)控過(guò)程，并且可能通過(guò)HIF-1-VEGF-Notch信號(hào)通路來(lái)調(diào)控

3、血管新生。
　　本研究通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)觀察腦缺血缺氧后miR-376b-5p、HIF-1-VEGF-Notch信號(hào)分子的表達(dá)變化和血管新生情況，并通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)觀察過(guò)表達(dá)和抑制miR-376b-5p對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞血管新生能力及HIF-1-VEGF-Notch信號(hào)通路分子表達(dá)的影響，探討miR-376b-5p對(duì)血管新生的調(diào)控作用及可能作用的信號(hào)途徑，以期為腦梗死的治療提供一種新策略。
　　方法:
　　1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　1.

4、1、構(gòu)建大鼠永久性局灶性大腦中動(dòng)脈腦缺血(Permanentmiddle cerebral artery occlusion，pMCAO)模型，于pMCAO后1天，3天，7天收集腦組織標(biāo)本。
　　1.2、通過(guò)神經(jīng)缺損評(píng)分和TTC染色方法鑒定建模是否成功。
　　1.3、通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)缺血腦皮質(zhì)區(qū)第八因子相關(guān)抗原因子(vWF)的表達(dá)情況從而判斷血管新生情況。
　　1.4、采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè)缺血腦皮質(zhì)區(qū)m

5、iR-376b-5p、HIF-1α mRNA、VEGFA mRNA、Notch1 mRNA的表達(dá)變化。
　　1.5、運(yùn)用Western blot的方法觀察缺血腦皮質(zhì)區(qū)HIF-1α、VEGFA、Notch1的蛋白表達(dá)變化。
　　2.體外實(shí)驗(yàn)
　　2.1、建立了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)缺氧模型。
　　2.2、運(yùn)用MTT，Transwell和Matrigel基質(zhì)膠實(shí)驗(yàn)比較常氧組和低氧組細(xì)胞的細(xì)胞增殖，細(xì)胞遷移以及

6、小管形成情況，從而可以判斷缺氧對(duì)血管新生的影響。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot的方法觀察常氧組和低氧組中HIF-1α、VEGFA、Notch1在mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化;運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè)缺氧對(duì)細(xì)胞中miR-376b-5p表達(dá)的影響。
　　2.3、進(jìn)一步通過(guò)在缺氧HUVEC細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-376b-5p模擬物或抑制物使miR-376b-5p過(guò)表達(dá)或者抑制表達(dá)，觀察轉(zhuǎn)染后內(nèi)皮細(xì)胞血管新生的能力以

7、及細(xì)胞中HIF-1α、VEGFA、Notch1在mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化，從而明確miR-376b-5p對(duì)血管新生的調(diào)控作用。
　　2.4、為了進(jìn)一步研究miR-376b-5p對(duì)血管新生的調(diào)控機(jī)制，我們構(gòu)建了HIF-1α shRNA表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)染入缺氧HUVEC細(xì)胞中以敲除HIF-1α的作用，通過(guò)比較HIF-1α被抑制前后，miR-376b-5p模擬物或抑制物對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞血管新生能力的影響以及細(xì)胞中HIF-1α、VEGFA、

8、Notch1分子在mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化，從而探討miR-376b-5p是否通過(guò)HIF-1-VEGF-Notch信號(hào)通路影響血管新生。
　　結(jié)果:
　　1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　1.1、成功構(gòu)建了大鼠永久性局灶性大腦中動(dòng)脈腦缺血(pMCAO)模型，TTC染色顯示:右側(cè)大腦中動(dòng)脈供血區(qū)的梗死區(qū)域呈白色，正常腦組織呈紅色。
　　1.2、免疫組化結(jié)果顯示:pMCA01天，3天，7天組缺血腦組織第八因子相關(guān)抗原因子(vWF

9、)表達(dá)水平與假手術(shù)組相比均上調(diào)，反映了pMCA01天，3天，7天組缺血區(qū)中微血管密度比假手術(shù)組均增加，提示腦缺血損傷可導(dǎo)致反應(yīng)性血管新生。
　　1.3、實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示: pMCAO后1天，3天，7天組缺血腦皮質(zhì)區(qū)miR-376b-5p的表達(dá)水平與假手術(shù)組相比均降低，并且HIF-1α mRNA、VEGFA mRNA、Notch1mRNA的表達(dá)均增加。
　　1.4Western blot結(jié)果顯示: pMCAO后1天，

10、3天，7天組缺血腦皮質(zhì)區(qū)HIF-1α、VEGFA、Notch1的蛋白表達(dá)與假手術(shù)組相比均增加。
　　2.體外實(shí)驗(yàn)
　　2.1、缺氧組與常氧組相比，miR-376b-5p的表達(dá)水平降低，而HUVEC的細(xì)胞增殖，細(xì)胞遷移以及小管形成能力增強(qiáng)，即血管新生能力增強(qiáng)，同時(shí)HIF-1α、VEGFA、Notch1在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)也增加，提示miR-376b-5p可能對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的血管新生具有抑制作用。
　　2.2、將mi

11、R-376b-5p模擬物轉(zhuǎn)染缺氧細(xì)胞后，內(nèi)皮細(xì)胞形成新生血管的能力減弱，同時(shí)HIF-1α、VEGFA、Notch1在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)也降低;而miR-376b-5p抑制物轉(zhuǎn)染缺氧細(xì)胞后，內(nèi)皮細(xì)胞形成新生血管的能力增強(qiáng)，同時(shí)HIF-1α、VEGFA、Notch1在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)也增加，初步明確了缺氧后miR-376b-5p可能通過(guò)HIF-1-VEGF-Notch信號(hào)通路調(diào)控了血管新生。
　　2.3、將HIF

12、-1α shRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入缺氧HUVEC細(xì)胞敲除HIF-1α的作用后，miR-376b-5p模擬物（或抑制物）與HIF-1α shRNA共轉(zhuǎn)染組與單純miR-376b-5p模擬物（或抑制物）轉(zhuǎn)染組相比，內(nèi)皮細(xì)胞形成新生血管的能力發(fā)生改變，同時(shí)HIF-1α、VEGFA、Notch1在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)也產(chǎn)生變化，進(jìn)一步明確了miR-376b-5p是通過(guò)調(diào)控HIF-1-VEGF-Notch信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮對(duì)血管新生的負(fù)調(diào)控作用