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文檔簡介
1、玉米大斑病是發(fā)生在玉米上的一種重要病害,嚴重流行的年份會造成感病品種的大幅度減產(chǎn)。玉米大斑病原菌的有性態(tài)為Setosphaeria turcica,稱玉米大斑剛毛座腔菌,屬于異宗配合子囊菌。菌株在有性繁殖階段分為兩個相反的交配型,即A交配型和α交配型。傳統(tǒng)鑒定交配型的方法為對峙培養(yǎng)法,需要的時間長、勞動強度大,因此需要建立一種更為方便有效的分子生物學(xué)方法。 本研究以玉米大斑病菌菌株40(交配型為A)、01-23(交配型為α)、0
2、3-08(交配型為Aa)為材料。利用CTAB方法提取了病菌的基因組DNA,根據(jù)已公開發(fā)表的子囊菌交配型基因MAT1-1和MAT1-2的保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計引物,從菌株01-23中擴增得到了一個長度為800bp左右的片段。對該片段進行了回收,與pMD-19T simple vector連接后,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞,利用M13引物進行PCR檢測,瓊脂糖凝膠電泳檢測插入片段的大小。利用ABI PRISM3730測序儀,對含有目的DNA片
3、段的質(zhì)粒進行測序。測序結(jié)果去除載體后,長度為859bp。生物信息學(xué)分析表明,該片段的編碼產(chǎn)物包含有一個α結(jié)構(gòu)域,屬于DNA結(jié)合蛋白家族。從菌株40中擴增得到了一個長度為250bp左右的片段,用同樣方法進行了回收和測序,長度為238bp。生物信息學(xué)分析表明,該片段的編碼產(chǎn)物包含有一個HMG-BOX結(jié)構(gòu)域,也屬于DNA結(jié)合蛋白家族。根據(jù)測序得到的核苷酸序列,設(shè)計了擴增交配型基因片段的特異引物;通過多次試驗,確定了最佳的PCR反應(yīng)條件。對部分
4、已知交配型的菌株進行的擴增結(jié)果表明,不同交配型的菌株分別含有不同的交配型基因片段,從而建立了鑒定菌株交配型的分子生物學(xué)方法。該方法比傳統(tǒng)的對峙培養(yǎng)方法更為準確,并且節(jié)省了時間,降低了勞動強度。 對兩性菌株03-08進行了有性態(tài)誘導(dǎo),發(fā)現(xiàn)自交能夠產(chǎn)生子囊殼,表明該菌株具有自交親和性。對03-08的基因組DNA進行了擴增,得到了交配型基因MAT1-1和MAT1-2的片段,表明兩性菌株的形成具有遺傳物質(zhì)基礎(chǔ),從一定程度上支持了真菌的同
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