雞核因子-κB受體激活物配基(chRANKL)基因的克隆、表達及生物學活性研究.pdf

1、核因子-кB受體激活物配基RANKL(receptor activator of NF-кB ligand，RANKL)最早發(fā)現(xiàn)于哺乳動物，屬于腫瘤壞死因子(TNF)超家族的一員，它參與破骨細胞形成的全過程：分化、融合、生存、激活，被認為是介導各種刺激因子誘導破骨細胞生成及功能信號傳導的最終因子。鑒于RANKL在骨代謝中的重要調節(jié)作用，本文旨在克隆表達蛋雞RANKL蛋白，并對其生物學活性進行研究，為進一步研究籠養(yǎng)蛋雞骨質疏松發(fā)生機制提供

2、新的思路。 試驗I、chRANKL編碼區(qū)基因的克隆與序列分析 應用RT-PCR方法從體外培養(yǎng)雞胚成骨細胞中擴增得到雞RANKL編碼基因(Genbank登錄號EF379383)，然后將特異性片段連接到pMD18-T載體，經(jīng)酶切、PCR鑒定及DNA序列測定。結果表明，擴增得到1203 bp的RANKL序列，擴增序列與GenBank上報道的預測序列具有很高的相似性，達到99.3％，與人、小鼠、犬的一致性分別為55.4％、52％

3、和55.7％，進化樹分析結果表明RANKL作為機體內調節(jié)骨代謝一種重要細胞因子，在進化中高度保守。RANKL基因的成功擴增為深入研究骨質疏松等代謝性骨病的發(fā)病機制及防治開辟廣闊的領域。 試驗II、chRANKL的原核表達和純化 設計一對引物用于克隆雞RANKL成熟蛋白編碼基因，然后構建雞RANKL原核表達載體pET-32a(+)-chRANKL，通過IPTG誘導表達重組雞RANKL成熟蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，原

4、核表達產(chǎn)物為64 kD的重組蛋白，并主要以包涵體形式存在，western blot分析結果顯示，表達得到的重組蛋白具有良好的抗原結合活性。 試驗III、chRANKL誘導雞骨髓細胞形成破骨樣細胞的研究 建立簡便有效的雞胚骨髓破骨樣細胞的誘導培養(yǎng)體系，獲得高密度高純度的破骨細胞，為進一步研究籠養(yǎng)蛋雞骨質疏松癥的發(fā)病機理奠定基礎。剔取18日齡雞胚脛骨和肱骨，用注射器抽取a-MEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，獲取的細胞懸液接種于培養(yǎng)板。

5、2h后吸取未貼壁細胞，離心重懸，使細胞密度為2×106/mL，接種于培養(yǎng)板，加入誘導劑RANKL和M-CSF，成功獲得具有破骨細胞特征的細胞：細胞大，多核；TRAP染色陽性，在骨片表面形成吸收陷窩；這表明chRANKL能誘導雞破骨細胞前體細胞形成OLC，說明chRANKL在雞OC分化、成熟過程中起重要作用。但加入chOPG后，則大大降低了OLC的形成以及OLC的骨吸收作用，表明chOPG阻斷了RANKL介導的OC分化和骨吸收作用。

6、 試驗IV、chRANKL在畢赤酵母中的表達和生物學活性研究 設計另一對引物用于克隆雞RANKL成熟蛋白編碼基因，然后構建雞RANKL真核表達載體pPICZa-A-chRANKL，以電穿孔法轉化酵母X-33，用Zeocin平板篩選重組子，經(jīng)甲醇誘導表達后，SDS-PAGE和免疫印跡分析表達產(chǎn)物，表達產(chǎn)物相對分子量為54 kDa，表達量約為220 mg/L，經(jīng)Western印跡驗證，表達得到的蛋白能夠與抗人RANKL IgG反應

7、，表明通過酵母表達得到的蛋白具有較好的免疫原性。 試驗V、chRANKL酵母凍干產(chǎn)物體內、體外對成熟破骨細胞的影響 50羽青年ISA蛋雞分為5組，A組為對照組，只注射生理鹽水，B、C、D、E組分別注射劑量為0.01 mg/kg，0.05 mg/kg，0.1 mg/kg，0.5 mg/kg的RANKL酵母表達凍干產(chǎn)物水溶物。2h后靜脈采血，測定血漿鈣離子濃度。同時將濃度為2 ng/mL，6ng/mL，10 ng/mL分別加