凡納濱對蝦血藍蛋白免疫學(xué)活性及其作用機制的研究.pdf

1、對蝦養(yǎng)殖是世界各地尤其是熱帶地區(qū)發(fā)展中國家的重要經(jīng)濟產(chǎn)業(yè)。隨著對蝦養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展,傳染性疾病特別是細菌性病和病毒性病給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失。因此,深入研究對蝦抗病機制,大力推進蝦類免疫學(xué)研究是最終戰(zhàn)勝蝦類病害的重要基礎(chǔ)。近年來研究表明,存在于蝦血淋巴中的血藍蛋白是一種具有抗病毒和抗細菌等多種免疫活性的多功能蛋白。本研究以凡納濱對蝦血藍蛋白為研究對象,在國內(nèi)外所獲研究結(jié)果的基礎(chǔ)之上,進一步對其免疫學(xué)活性及作用機理進行研究,為豐富蝦類免疫

2、系統(tǒng)研究,探索對蝦疾病免疫學(xué)防治奠定基礎(chǔ)。
　　實驗結(jié)果顯示,用2種不同抗體親和純化所得2種血藍蛋白:LHt(抗體為兔抗血藍蛋白全蛋白)和LH75(抗體為兔抗血藍蛋白75 kDa亞基)。其均由75 kDa和77 kDa2個亞基組成;糖含量分別為1.5％和3%,通過凝集素印跡檢測到血藍蛋白含α-D甘露糖/α-D葡萄糖、α-D-N-乙酰半乳糖胺、α-L-海藻糖和β-D-半乳糖(1-3)-D-乙酰半乳糖胺四種糖基,其中,LH75中α-D

3、甘露糖/α-D葡萄糖含量為LHt的1.2倍,α-D-N-乙酰半乳糖胺含量為后者的1.5倍,說明血藍蛋白在糖基化修飾水平存在多樣性。
　　對兩種血藍蛋白進行細菌凝集實驗發(fā)現(xiàn),LH75凝集活性明顯高于LHt,前者為后者的4倍。凝集抑制實驗表明,細菌外膜蛋白可以抑制血藍蛋白對大腸桿菌K12、副溶血弧菌、溶藻酸弧菌、河弧菌、哈維氏弧菌、嗜水氣單胞菌和金黃色葡萄球菌等7種細菌的凝集活性。血藍蛋白對大腸桿菌外膜蛋白敲除菌凝集結(jié)果顯示,血藍蛋白

4、對△OmpX的凝集特異性明顯降低,推測OmpX為血藍蛋白與病原菌的凝集作用靶標(biāo)。
　　體外抑菌實驗表明,血藍蛋白對大腸桿菌K12和副溶血弧菌、溶藻酸弧菌等8種蝦類致病菌均有抑制作用,但LHt和LH75抑菌效果存在顯著性差異。通過血藍蛋白對大腸桿菌 K12外膜蛋白敲除菌抑菌實驗發(fā)現(xiàn),與大腸桿菌 K12野生菌株相比,血藍蛋白對△OmpC、△OmpW、△OmpFDL和△OmpTSX抑菌活性明顯降低,推測OmpC、OmpW、OmpFDL和

5、OmpTSX可能為血藍蛋白與病原菌的抑菌作用靶標(biāo)。
　　溶血實驗顯示,血藍蛋白對多種動物紅細胞表現(xiàn)出依賴于Ca2+的溶血活性,且LH75溶血活性明顯高于LHt。血藍蛋白溶血活性pH6.0時最高,在pH6~10,溶血活性隨pH值升高而降低。血藍蛋白濃度與溶血活性表現(xiàn)出劑量-效應(yīng)正相關(guān),表明血藍蛋白分子協(xié)同作用引起溶血。滲透保護實驗發(fā)現(xiàn)隨著加入的滲透保護劑分子的增大,溶血活性降低,表明血藍蛋白溶血機制可能為膠體滲漏機制。通過對血藍蛋白

6、處理后的紅細胞膜進行SDS-PAGE及免疫印跡分析發(fā)現(xiàn),血藍蛋白以聚合物形式緊密結(jié)合到紅細胞膜上。由此可以認為,血藍蛋白的溶血機制可能為:血藍蛋白以聚合體的形式緊密結(jié)合到紅細胞膜上形成離子滲透孔,引起膠體滲漏導(dǎo)致溶血。至于血藍蛋白分子與紅細胞膜作用靶標(biāo)還需進一步研究證實。
　　綜上所述,本課題研究主要發(fā)現(xiàn):①凡納濱對蝦血藍蛋白具有凝集、抑菌和溶血活性;②血藍蛋白具有糖基修飾多樣性,其糖含量高低與其免疫學(xué)活性呈正相關(guān);③血藍蛋白與病