XAV939抑制人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖及相關(guān)機(jī)制的研究.pdf

1、前言：
　　母細(xì)胞瘤(Neuroblastoma，NB)是最常見的嬰幼兒顱外實(shí)體腫瘤，是一種胚胎期的交感神經(jīng)節(jié)后腫瘤。大多起源于腎上腺，約占所有兒童腫瘤的8-10％，死亡率約15％，是目前兒科亟待解決的難題。該病具有自發(fā)轉(zhuǎn)歸、變形或侵襲行為的能力，預(yù)后很差。目前治療高度惡性NB的方法包括化療、手術(shù)和放療。即使經(jīng)過這些方法的綜合治療，能達(dá)到長期治愈的兒童不足40％。之后患者還要經(jīng)歷腫瘤復(fù)發(fā)及高劑量化療后導(dǎo)致的并發(fā)癥。因此亟需一種高效

2、低毒的治療方法，而以小分子為靶向的藥物治療則成為有潛力的代表。
　　Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)通路是Wnt通路中研究最多的通路，也稱為經(jīng)典通路，是一個(gè)高度保守的通路，與人類出生缺陷、癌癥和其他疾病等有關(guān)。在胚胎發(fā)育過程中，Wnt家族參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞極性和細(xì)胞的命運(yùn)，是最基本的轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制之一。已有研究表明，Wnt信號(hào)通路的失調(diào)發(fā)生在幾種類型的癌癥中，包括結(jié)腸癌，肝癌及神經(jīng)外胚層來源的腦腫瘤。Wnt/β-caten

3、in信號(hào)通路的一個(gè)重要特征是轉(zhuǎn)錄助激活劑β-catenin的穩(wěn)定性，它受由軸蛋白(Axin)、結(jié)直腸腺瘤性息肉(adenomatous polyposis coli，APC)易感基因的蛋白產(chǎn)物、糖原合成酶激酶3(glycogen synthase kinase3，GSK3)和酪蛋白激酶1(casein kinase1，CK1)組成的降解復(fù)合物的調(diào)節(jié)。當(dāng)Wnt刺激信號(hào)缺失時(shí)，β-catenin通過泛素化/蛋白激酶途徑被磷酸化而降解。而當(dāng)W

4、nt信號(hào)存在時(shí)，Axin介導(dǎo)的β-catenin的磷酸化被抑制，從而引起β-catenin在胞漿中累積并進(jìn)入細(xì)胞核，與淋巴細(xì)胞強(qiáng)化因子（1ymphoid enhancing factor，LEF）或T細(xì)胞趨化因子(T cell factor，TCF)家族結(jié)合，激活Wnt通路的下游轉(zhuǎn)錄基因，如smad4、tsh、cyclin D1、c-myc等，致使細(xì)胞異常增殖，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。因此，抑制Wnt信號(hào)通路已成為一個(gè)引入矚目

5、的治療癌癥的策略。
　　近年發(fā)表在Nature雜志的一項(xiàng)令人振奮的研究成果，連同更早的一項(xiàng)，已經(jīng)證實(shí)一個(gè)新的小分子抑制劑XAV939能夠在結(jié)腸癌細(xì)胞系中阻斷Wnt信號(hào)通路，通過與端錨復(fù)合酶（tankyrase，TNKS）的多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly-ADP-ribose polymerase，PARP)催化區(qū)結(jié)合，引起Axin蛋白的穩(wěn)定化，因此導(dǎo)致β-catenin降解增加。已有報(bào)道，作為TNKS家族的主要成員之一，tan

6、kyrasel(TNKS1)可在一些腫瘤中上調(diào)，包括多發(fā)性骨髓瘤、漿細(xì)胞性白血病、高度惡性非霍奇金氏淋巴瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌和膀胱癌等。這提示TNKS1在腫瘤進(jìn)展中起到一定作用。
　　端粒、端粒酶以及TNKS與人類“細(xì)胞老化”及“細(xì)胞永生化”有著重要而特殊的關(guān)系，這種相關(guān)性為老年病和腫瘤的研究帶來了新的機(jī)遇。端粒(telomere)是存在于真核細(xì)胞線狀染色體末端的一小段DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，它與端粒結(jié)合蛋白一起構(gòu)成了特殊的“帽子”樣

7、結(jié)構(gòu)，能夠維持染色體的完整。端粒酶是由RNA和蛋白質(zhì)組成的核糖核蛋白復(fù)合體，屬于“反轉(zhuǎn)錄酶”。人類的端粒酶亞單位基因已被復(fù)制出來，分別是端粒酶RNA(hTR)、端粒酶結(jié)合蛋白(hTP1)和端粒酶活性催化單位(hTERT)。端粒酶的功能主要是維持端粒的長度。它能利用端粒3'末端為引物，以自身RNA為模板合成端粒-TTAGGG-重復(fù)序列添加到染色體末端，從而維持端粒原有的長度。在正常人體細(xì)胞中，端粒酶的活性受到相當(dāng)嚴(yán)密的調(diào)控，只有在造血細(xì)胞

8、、干細(xì)胞和生殖細(xì)胞，這些必須不斷分裂克隆的細(xì)胞中，才可以檢測(cè)到有活性的端粒酶。當(dāng)細(xì)胞分化成熟后，端粒酶的活性就會(huì)逐漸消失。但在惡性腫瘤細(xì)胞中，端粒酶活性異常增高而使體細(xì)胞表現(xiàn)出無限增殖的特性。
　　TNKS屬于二磷酸腺苷核糖多聚合酶，有1和2兩種。TNKS1定位于8號(hào)染色體p23.1，蛋白由1237個(gè)氨基酸殘基組成。主要有4個(gè)結(jié)構(gòu)域，從氨基端向羧基端依次為:1）HPS結(jié)構(gòu)域;2）ANK結(jié)構(gòu)域;3）SAM結(jié)構(gòu)域;4）聚腺苷二磷酸核糖

9、聚合酶(PARP)結(jié)構(gòu)域。因此TNKS1具有明確的PARP活性。但它并不能直接影響端粒酶的活性，而是通過使端粒結(jié)合蛋白TRF1核糖基化而喪失結(jié)合端粒DNA的能力，從而解除了TRF1對(duì)端粒結(jié)構(gòu)的束縛作用，使端粒處于一種“開放”的結(jié)構(gòu)狀態(tài)，容易使端粒酶和其他因子接近端粒末端，催化端粒的延長，維持癌細(xì)胞端粒長度的穩(wěn)定性，保證癌細(xì)胞持續(xù)生長增殖。因此，TNKS1是人體內(nèi)端粒酶激活、端粒延長的正調(diào)控因子。常用的端粒酶抑制劑需要較長的治療周期，腫瘤

10、細(xì)胞容易產(chǎn)生耐藥性，對(duì)具有端粒酶活性的正常組織，如骨髓、生殖系統(tǒng)等產(chǎn)生影響，因此治療效果并不理想。
　　2001年，Reya等首次提出腫瘤干細(xì)胞(Tumor stem cells，TSCs)理論。2006年美國癌癥研究協(xié)會(huì)(American Association for Cancer Research)對(duì)TSCs給出的明確定義是:腫瘤中具有自我更新能力并能產(chǎn)生異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞。TSCs理論認(rèn)為，TSCs是腫瘤不斷復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的

11、根源，只有完全消滅了TSCs，腫瘤才能被徹底治愈。TSCs理論的提出，為腫瘤研究提供了全新的視角，并逐漸成為研究熱點(diǎn)和主流趨勢(shì)。由于TSCs大多處于休眠狀態(tài)，停滯于細(xì)胞周期中的G0期，且高表達(dá)三磷酸腺苷結(jié)合盒（ATP-binding cassette，ABC）家族膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及多藥耐藥蛋白(multidrug resistance protein，MDRP)，可將藥物及毒性物質(zhì)等運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外，因而對(duì)常規(guī)化療藥不敏感，是導(dǎo)致腫瘤化療失敗的主

12、要原因。因此，分離和純化出腫瘤中存在的TSCs，并將其作為靶點(diǎn)，利用小分子藥物對(duì)其進(jìn)行靶向殺傷，同時(shí)結(jié)合化療藥殺死腫瘤細(xì)胞的多靶點(diǎn)聯(lián)合治療策略被認(rèn)為是腫瘤治療的新模式，有望徹底根治腫瘤。
　　本研究在檢測(cè)到TNKS1在NB細(xì)胞系SH-SY5Y細(xì)胞高表達(dá)的基礎(chǔ)上，采用XAV939處理細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期的改變，又采用RNAi的方法阻斷TNKS1基因的表達(dá)，再檢測(cè)細(xì)胞的克隆形成率、Wnt/β-catenin信號(hào)通路及

13、抗凋亡蛋白、端粒長度、端粒酶活性、細(xì)胞凋亡等的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及侵襲能力的變化。探討XAV939抑制細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)其凋亡的機(jī)制。在此基礎(chǔ)上，分選出NB干細(xì)胞，并用XAV939及RNAi-TNKS1處理，觀察其超微結(jié)構(gòu)、TSCs標(biāo)志物的表達(dá)及遷移能力的改變，探究其對(duì)NB干細(xì)胞的自我更新能力，即“干性”(Stemness)的影響，為探索NB治療的新靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。
　　材料與方法：
　　1、RT-PCR檢測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞中TN

14、KS1 mRNA的表達(dá)。
　　2、MTT法檢測(cè)不同濃度XAV939對(duì)細(xì)胞增殖活力的影響，并確定最佳使用濃度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。
　　3、Annexin V FITC法和Hoechst33342染色法檢測(cè)XAV939處理后細(xì)胞凋亡的情況。
　　4、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)XAV939處理后細(xì)胞周期的改變。
　　5、用RNAi的方法阻斷TNKS1基因的表達(dá)，并用Real-Time PCR檢測(cè)干擾效果，確定最佳干擾序列進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。<

15、br>　　6、XAV939處理和RNAi-TNKS1后，用體外克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞克隆形成能力的改變，用Western blot法檢測(cè)Wnt/β-catenin信號(hào)通路及抗凋亡蛋白Bcl-2的變化。
　　7、XAV939處理和RNAi-TNKS1后，用Real-Time PCR法檢測(cè)端粒長度的改變，TRAP-ELISA法檢測(cè)端粒酶活性的變化，透射電鏡觀察細(xì)胞凋亡的超微結(jié)構(gòu)，Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力的變化。

16、
　　8、分別用Hoechst33342染色法分選SP細(xì)胞和CD133抗體染色法分選陽性細(xì)胞，并確定最佳的TSCs的分選方法。
　　9、用不同濃度Etoposide處理的方法富集NB干細(xì)胞，分選后擴(kuò)增培養(yǎng)，并用電鏡觀察其超微結(jié)構(gòu)。
　　10、將培養(yǎng)擴(kuò)增的NB干細(xì)胞用XAV939和RNAi-TNKS1處理后，用Real-TimePCR檢測(cè)NB干細(xì)胞中CD133mRNA的表達(dá)，Western blot檢測(cè)其CD133蛋白的

17、表達(dá)，免疫熒光檢測(cè)其CD133蛋白的亞細(xì)胞定位表達(dá)，Transwell法檢測(cè)NB干細(xì)胞的遷移能力。
　　結(jié)果：
　　1、RT-PCR結(jié)果顯示，與海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT-22相比，SH-SY5Y細(xì)胞高表達(dá)TNKS1 mRNA。
　　2、MTT結(jié)果顯示，1μM XAV939作用24h后，SH-SY5Y細(xì)胞的增殖活力有明顯下降，到72h時(shí)下降達(dá)最大值。當(dāng)濃度為1，5，10和50μM，時(shí)間為24h，48h和72h時(shí)，這種抗增殖作

18、用呈劑量和時(shí)間依賴性。后續(xù)試驗(yàn)均采用1μM XAV939進(jìn)行干預(yù)。
　　3、Annexin V/FITC法和HoechSt33342染色法的結(jié)果均顯示，SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)XAV939處理24h后沒有明顯的凋亡，而處理48h或72h后，實(shí)驗(yàn)組凋亡率明顯高于對(duì)照組，且隨著時(shí)間的增加而增加。
　　4、細(xì)胞周期的結(jié)果顯示，XAV939處理后24h、48h及72h，處于G0/G1期的細(xì)胞減少，而G2/M期及S期的細(xì)胞增多。
　

19、　5、慢病毒轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示，當(dāng)培養(yǎng)基為完全培養(yǎng)基+5ug/ml polybrene，MOI值為10時(shí)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染率達(dá)到80％左右，狀態(tài)較佳。Real-Time PCR檢測(cè)干擾效果顯示，＃3 shRNA的干擾率達(dá)60％左右，效果最佳。
　　6、Western blot結(jié)果顯示，通過XAV939處理或RNAi-TNKS1后可減少抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá);此外，Wnt/β-catenin通路的樞紐蛋白β-catenin及其下游靶蛋白Cye

20、lin D1和c-Myc的表達(dá)也降低。
　　7、Real-Time PCR結(jié)果顯示，XAV939處理和RNAi-TNKS1后，端粒長度均較對(duì)照組縮短，但端粒酶活性沒有明顯變化，透射電鏡可觀察到線粒體明顯腫脹，形成空泡，染色質(zhì)凝聚等典型的凋亡或壞死形態(tài)，細(xì)胞侵襲能力有不同程度的降低。
　　8、流式細(xì)胞儀分析的結(jié)果顯示，Hoechst33342染色法分選的SP細(xì)胞比率約為0.8％，但SP細(xì)胞群不明顯，特異性差，且染料對(duì)細(xì)胞損傷大

21、。CD133抗體染色法分選的陽性細(xì)胞比率約為0.78％，該方法特異性較強(qiáng)，對(duì)細(xì)胞損傷小，步驟簡(jiǎn)單，因此后續(xù)研究采用該方法進(jìn)行。
　　9、流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，60μM Etoposide處理后CD133陽性細(xì)胞的比率最高，因此用該濃度的Etoposide進(jìn)行NB干細(xì)胞的富集。掃描電鏡可見，CD133陽性細(xì)胞呈圓形或卵圓形，突起細(xì)小，表面有豐富的微絨毛并聚集成球生長，表明其處于未分化狀態(tài);透射電鏡顯示，CD133陽性細(xì)胞核-質(zhì)比高

22、，細(xì)胞器不發(fā)達(dá)，處于原始幼稚階段。
　　10、XAV939處理和RNAi-TNKS1后，Real-Time PCR結(jié)果顯示，NB干細(xì)胞的CD133mRNA表達(dá)降低，Western blot結(jié)果顯示CD133蛋白表達(dá)降低，免疫熒光結(jié)果顯示CD133蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度降低，Transwell結(jié)果顯示NB干細(xì)胞的遷移能力下降。
　　結(jié)論：
　　1、TNKS1 mRNA在NB細(xì)胞系SH-SY5Y細(xì)胞中的表達(dá)升高。<

23、br>　　2、XAV939可抑制SH-SY5Y細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，使細(xì)胞停滯在G2/M期及S期。
　　3、XAV939處理和RNAi-TNKS1均可誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡，降低其體外克隆形成率和侵襲能力，使端粒長度縮短，但端粒酶活性并無明顯變化，提示其發(fā)揮作用的機(jī)制不是直接抑制端粒酶，而是通過抑制TNKS1進(jìn)而抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路所致。
　　4、Hoechst33342染色法適用于無明顯表面標(biāo)志的TS