HBHA在MTB感染AECⅡ過程中的作用研究.pdf

1、結(jié)核分枝桿菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）致全世界近1/3的人受到感染，每年新發(fā)結(jié)核病人達800萬,200萬人死于結(jié)核病。到目前為止,被研究證實的MTB致病因子并不多。其中，肝素結(jié)合血凝素蛋白（heparin-bindinghemagglutininadhesinHBHA)是近年來研究發(fā)現(xiàn)的MTB重要致病因子之一。HBHA蛋白是一個28-kD的細菌表面粘附素，它具有誘導MTB粘附非巨噬細胞，介導MTB肺外

2、播散等多種生物學活性。但是HBHA蛋白在MTB感染過程中的具體作用還有待于進一步的探討。本課題克隆表達并提取了天然HBHA蛋白，初步研究了該蛋白在MTB與上皮細胞相互作用中的功能。
　　1、結(jié)核分枝桿菌HBHA基因的克隆表達及蛋白的純化
　　在GenBank中檢索出HBHA基因的DNA序列，用引物設(shè)計軟件PrimerPremier5.0設(shè)計含BamHⅠ和HindIII酶切位點的特異性引物。以結(jié)核分枝桿菌基因組DNA為模板，利

3、用PCR方法擴增出600bp目的基因。將目的基因克隆入克隆表達載體pQE-80L，測序結(jié)果Blast比對正確后，用IPTG進行誘導表達，SDS-PAGE電泳證實成功表達了28-kD目的蛋白。將誘導后的重組菌體超聲裂解后，分別取上清和沉淀做SDS-PAGE電泳，發(fā)現(xiàn)表達的蛋白以可溶性形式存在。隨后用HisGravitrap親和層析柱純化可溶性蛋白，獲得重組HBHA蛋白（rHBHA）的濃度為10.98mg/mL，分裝后保存于－20℃?zhèn)溆谩２?/p>

4、以此免疫新西蘭兔制備抗rHBHA蛋白的多克隆抗體。
　　2、天然HBHA蛋白提取以及HBHA蛋白部分生物活性觀察
　　用7H9液體培養(yǎng)基培養(yǎng)卡介苗（BCG）至穩(wěn)定生長期，離心收集BCG菌體，用PBS重懸菌體，冰浴條件下超聲裂解。離心并留取上清。將上清通過已用PBS平衡的HeparinSepharoseCL-6B柱子，用不同NaCl鹽離子濃度梯度的PBS將天然HBHA洗脫，收集各濃度梯度洗脫蛋白。取少量樣品進行SDS-PAGE

5、電泳，并用Westernblot鑒定，證實得到天然HBHA蛋白（nHBHA）。將獲得的nHBHA分裝后保存于-20℃?zhèn)溆?。分別用不同濃度的rHBHA和nHBHA加入到培養(yǎng)BCG的7H9液體培養(yǎng)基中，36小時后觀察其誘導BCG聚集情況。同時，將HBHA蛋白與抗HBHA抗體以最適比例37℃孵育一小時后，再將孵育過的蛋白加入到BCG培養(yǎng)基中，36小時觀察抗體對不同濃度nHBHA和rHBHA誘導BCG聚集效應(yīng)的影響。結(jié)果顯示所得天然和重組蛋白均

6、有誘導BCG聚集的作用，并且天然HBHA誘導聚集能力強于重組HBHA蛋白，此種凝集均可被抗rHBHA多克隆抗體抑制。
　　3、HBHA蛋白在MTB與上皮細胞相互作用中的功能機制研究
　　分別用不同濃度的rHBHA和nHBHA作用于饑餓誘導后的A-549細胞，通過Westernblot和RT-PCR技術(shù)檢測細胞自噬相關(guān)分子LC3在蛋白水平和基因水平的變化。結(jié)果顯示隨著HBHA蛋白濃度的增高，A-549細胞內(nèi)LC3表達無論在基因