無腦畸形microRNAs表達(dá)譜及功能研究.pdf

1、第一部分無腦畸形胎兒腦組織microRNAs的差異表達(dá)
　　背景：神經(jīng)管畸形（neural tube defects，NTDs）是人類最常見的一種出生缺陷，其中無腦畸形是最常見的類型之一。NTDs的病因非常復(fù)雜，目前認(rèn)為主要是遺傳和環(huán)境的相互作用造成。microRNAs是一種參與基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的非編碼RNAs，在多種生命活動(dòng)如胚胎神經(jīng)發(fā)育中均可發(fā)揮重要作用，隨著人們對(duì)microRNAs的逐漸認(rèn)識(shí)，推測(cè)其和相應(yīng)的靶基因有可能在N

2、TDs的發(fā)生中起作用。
　　目的：探討無腦畸形胎兒殘存腦組織和正常引產(chǎn)胎兒腦組織中microRNAs的差異表達(dá)譜，并運(yùn)用生物信息學(xué)手段預(yù)測(cè)這些miRNAs的靶基因。
　　方法:利用Affymetrix公司推出的GeneChip? miRNA表達(dá)譜芯片分析無腦畸形胎兒殘存腦組織和正常引產(chǎn)胎兒腦組織中miRNAs的差異表達(dá)。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time RT-PCR）對(duì)差異表達(dá)顯著的10個(gè)miRNAs進(jìn)行進(jìn)一

3、步驗(yàn)證。運(yùn)用數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)上述經(jīng)過驗(yàn)證的miRNAs的靶基因。
　　結(jié)果:1. miRNA芯片初篩結(jié)果：與正常對(duì)照組相比，無腦兒組有87個(gè)miRNAs表達(dá)差異顯著（兩組差異＞2倍）。其中表達(dá)上調(diào)的miRNAs有73個(gè)，表達(dá)下調(diào)的有14個(gè)。
　　2.根據(jù)表達(dá)差異顯著性程度和在腦組織中表達(dá)的特異性，選取上述有顯著表達(dá)差異的miRNAs中的10個(gè)miRNAs行real-time PCR進(jìn)行驗(yàn)證。發(fā)現(xiàn)mir-103、mir-132、mi

4、r-138、mir-185、mir-23a、mir-134、mir-22、mir-34a和mir-149的檢測(cè)結(jié)果與miRNA芯片初篩結(jié)果一致，其中表達(dá)上調(diào)的有mir-103、mir-132、mir-138、mir-185、mir-23a、mir-134、mir-22和mir-34a；表達(dá)下調(diào)的為mir-149。mir-125a的結(jié)果與芯片結(jié)果相反。
　　結(jié)論:經(jīng)過miRNA芯片初篩和進(jìn)一步的real-time PCR驗(yàn)證，一定數(shù)

5、目的miRNAs可能通過調(diào)控多個(gè)途徑中的靶基因從而參與無腦畸形的發(fā)生。
　　第二部分miR-34a對(duì)人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中Notch信號(hào)通路的影響
　　背景:既往研究發(fā)現(xiàn)一些miRNAs對(duì)葉酸代謝和NTDs的發(fā)生可能有一定的影響，尤其是miR-34a。根據(jù)前期數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)Notch1和Dll1基因可能是受miR-34a調(diào)控的靶基因。同時(shí)有研究結(jié)果顯示Notch信號(hào)通路在胚胎神經(jīng)形成過程中可能起著重要的調(diào)節(jié)作用，故推測(cè)miRNA可能

6、通過調(diào)控如Notch等重要的信號(hào)通路影響神經(jīng)形成過程。
　　目的:根據(jù)前期芯片的篩選結(jié)果，探討miR-34a對(duì)人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤Notch信號(hào)通路的影響。
　　方法:利用miR-34a mimics脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株U87，轉(zhuǎn)染24h后用real-time RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)Notch信號(hào)途徑中Notch1和Dll1基因mRNA和蛋白表達(dá)水平，同時(shí)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后胞內(nèi)miR-34a的mR

7、NA水平。
　　結(jié)果:經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-34a mimics的U87細(xì)胞內(nèi)has-miR-34a表達(dá)明顯升高，而Notch1和Dll1基因的mRNA水平?jīng)]有明顯變化，蛋白表達(dá)水平則有明顯降低。
　　結(jié)論：miR-34a mimics可通過上調(diào)胞內(nèi)miR-34a的水平，從而抑制其預(yù)測(cè)靶基因Notch1和Dll1的蛋白而非mRNA的表達(dá)，提示它是在轉(zhuǎn)錄后的翻譯水平發(fā)揮對(duì)靶基因的調(diào)控作用。miR-34a可能通過下調(diào)Notch信號(hào)途徑而