肝癌轉(zhuǎn)移特征性microRNAs的篩選及功能鑒定.pdf

1、論文題目肝癌轉(zhuǎn)移特征性microRNAS的篩選及功能鑒定SereeningandMetastasis一assoeiatedMieroRNAsIdentifieationofinHumanHePatoeellularCareinoma導(dǎo)師組成員:孫惠川教授王魯副教授本課題由國(guó)家自然科學(xué)基金(30670953，81071904)和國(guó)家科技重大專項(xiàng)(2008ZX10002一021)項(xiàng)目資助復(fù)旦大學(xué)碩士學(xué)位論文中文摘要背景與目的:miCrNAs

2、(miRNAs)是一種短鏈非編碼小RNA，通過(guò)與其靶基因mRNA3’UTR區(qū)結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后抑制作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、分化、代謝、運(yùn)動(dòng)以及參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。近年來(lái)有研究證實(shí)，miRNAS的差異表達(dá)與肝癌的轉(zhuǎn)移、藥物治療反應(yīng)性以及預(yù)后相關(guān)。本研究著重探索人肝癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中差異表達(dá)miRNAs，并鑒定其中關(guān)鍵miRNAS的生物學(xué)功能，以期進(jìn)一步理解肝癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，為肝癌的個(gè)體化治療提供線索。方法:應(yīng)用miRNAs表達(dá)譜芯片檢測(cè)裸鼠原位

3、移植瘤肝癌原發(fā)灶和肺轉(zhuǎn)移灶中miRNA表達(dá)，根據(jù)SAM的差異倍數(shù)篩選肝癌侵襲轉(zhuǎn)移鏈特異性差異表達(dá)miRNAS譜利用生物信息學(xué)技術(shù)分析并構(gòu)建差異表達(dá)miRNAS的生物學(xué)事件調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Poly(A)real一tifnePCR檢測(cè)miRNAS的表達(dá)水平Real一timePCR和Westernblot分別檢測(cè)功能基因的mRNA和蛋白質(zhì)水平Trans一wen和BDMatrigel用來(lái)觀察細(xì)胞的遷移、侵襲能力進(jìn)而對(duì)miR612的靶基因及相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)

4、行生物信息學(xué)再預(yù)測(cè)和功能富集分析構(gòu)建Dual一LuCiferaserepterveCt直接驗(yàn)證miR612的靶基因。通過(guò)miR丁DINAmimie和hairpininhibit及LipofeCtamin2000細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，實(shí)現(xiàn)miR612的瞬時(shí)過(guò)表達(dá)或封閉表達(dá)。利用AKTZ選擇性抑制劑VIH阻斷AKTZ的活化和下游信號(hào)通路的激活。尾靜脈注射裸鼠模型在體觀察腫瘤的肺轉(zhuǎn)移能力。結(jié)果:1)在肝癌侵襲一轉(zhuǎn)移鏈中特異性差異表達(dá)miRNAS有32

5、條，其中上調(diào)15條，下調(diào)17條聚類(lèi)分析可將上述32條差異表達(dá)miRNAS歸類(lèi)為原發(fā)灶和肺轉(zhuǎn)移灶兩種獨(dú)特表達(dá)模式根據(jù)預(yù)測(cè)的靶基因這些差異表達(dá)miRNAS可能參與18項(xiàng)生物學(xué)事件2)在HCCLM3、MHCC97H、MHCC97L、HepGZ和SMMC一7721中miR612的表達(dá)水平呈逐漸升高趨勢(shì)，其中SMMC一7721的表達(dá)水平是HCCLM3的巧倍，表明miR612的表達(dá)水平與不同來(lái)源肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移潛能呈負(fù)相關(guān):3)在HCCLM3、M

6、HCC97H及MHCC97L細(xì)胞中miR612的水平與其遷移、侵襲能力呈反向關(guān)系在HCCLM3不同亞克隆中，miR612表達(dá)也存在顯著性差異，而這種差異與不同亞克隆的遷移、侵襲能力呈負(fù)相關(guān)。4)miRID工NAmimiCS瞬時(shí)轉(zhuǎn)染能夠顯著抑制HCCLM3、HePGZ細(xì)胞的遷移和侵襲能力，而hairPininhibit封閉miR61272h后可顯著增加遷移和侵襲能力5)應(yīng)用miRa，TargetSCan以及mirargetZ方法對(duì)miR6