p8在非小細(xì)胞肺癌中的功能及轉(zhuǎn)錄調(diào)控.pdf

1、目的:轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子p8是細(xì)胞脅迫相關(guān)基因，在唾液腺、胃腸、肝臟、腎臟及肺部有低水平的組成型表達(dá)，壓力條件會(huì)促使其表達(dá)增高并參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡等過程。據(jù)報(bào)道，p8與各種腫瘤的發(fā)生發(fā)展和惡性轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，一方面，p8能夠促進(jìn)胰腺癌、乳腺癌、甲狀腺癌和膠質(zhì)瘤等腫瘤性疾病的進(jìn)程;另一方面，p8對(duì)于前列腺癌有一定抑制作用。目前，p8在肺癌中的研究較少并且該基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制也罕有報(bào)道。希望通過本研究，在人類非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中探究p8的功能

2、，以及p8基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，為更進(jìn)一步理解肺癌的發(fā)生發(fā)展，尋找分子治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。
　　方法:本實(shí)驗(yàn)分為兩部分進(jìn)行，第一部分主要研究p8對(duì)非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展的影響，第二部分則主要研究p8基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。第一部分實(shí)驗(yàn)，首先通過熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR及免疫組化，對(duì)各種腫瘤細(xì)胞系及非小細(xì)胞肺癌組織中p8的表達(dá)水平進(jìn)行檢測;接下來在高表達(dá)p8的腫瘤細(xì)胞系中利用shRNA下調(diào)p8的表達(dá)，并觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，然后通過West

3、ern blot檢測相關(guān)蛋白分子表達(dá)水平的變化，利用免疫熒光和吖啶橙染色等對(duì)下調(diào)p8表達(dá)的細(xì)胞所出現(xiàn)的各種形態(tài)學(xué)變化進(jìn)行了分析，同時(shí)也通過BrdU增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、體外軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)、β-半乳糖苷酶染色和流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期檢測等方法，對(duì)下調(diào)p8表達(dá)的細(xì)胞的生物學(xué)功能進(jìn)行了研究。在第二部分實(shí)驗(yàn)中，利用ChIP及BSP對(duì)p8基因上游非編碼序列的組蛋白乙?；?、甲基化及DNA甲基化修飾進(jìn)行了檢測，并通過3C(chromatin con

4、formation capture)技術(shù)對(duì)該段染色質(zhì)的空間構(gòu)象進(jìn)行了分析，最后利用Luciferase實(shí)驗(yàn)，對(duì)3C實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的3個(gè)相互作用的片段的功能進(jìn)行了分析。
　　結(jié)果:第一部分實(shí)驗(yàn)，通過對(duì)HUVEC，A549，H1155，H441，H69，H209，BEAS-2B，Hep3B,HepG2,SK-BR-3,MCF-7,MDA-MB-231,HeLa,U937及CRL-2922細(xì)胞系的檢測，發(fā)現(xiàn)p8在不同細(xì)胞系中表達(dá)存在差異，其

5、中非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549及肝癌細(xì)胞Hep3B中p8表達(dá)水平極高，下調(diào)p8的表達(dá)會(huì)造成細(xì)胞形態(tài)及功能等方面的改變。首先，細(xì)胞指狀突起增多，E-cadherin，β-cantenin表達(dá)水平上升并在細(xì)胞膜上富集，而vimentin則出現(xiàn)下降，細(xì)胞體外遷移率降低(p＜0.001)，提示細(xì)胞發(fā)生了MET;同時(shí)，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量光鏡可見的囊泡結(jié)構(gòu)，透射電鏡可見囊泡具有吞噬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細(xì)胞器的功能;細(xì)胞內(nèi)LC3B-Ⅱ增多并在囊泡周圍富集，囊泡能

6、夠被吖啶橙著色，表現(xiàn)為橙色熒光，而3-MA和氯喹能夠抑制囊泡的形成，說明囊泡可能來源與自噬小體與溶酶體的融合;下調(diào)p8表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞體外增殖及克隆形成能力明顯下降(p＜0.001)，細(xì)胞被阻滯在G1期，表明細(xì)胞自噬后期發(fā)生阻斷。第二部分實(shí)驗(yàn)，ChIP及BSP檢測結(jié)果顯示，活躍的p8基因啟動(dòng)子區(qū)域富集組蛋白H3K9乙?；虷3K4雙甲基化修飾，而CpG位點(diǎn)低甲基化，但突變CpG位點(diǎn)并不能顯著影響p8基因的活性;p8基因上游約14kb的非

7、編碼序列中H3K4單甲基化和H3K27乙?；揎棾潭鹊?，同時(shí)3C實(shí)驗(yàn)證實(shí)該非編碼區(qū)的環(huán)狀空間構(gòu)象拉近了位于其上的C1，C2及C3片段的距離，形成一個(gè)復(fù)合體，并通過與啟動(dòng)子結(jié)合影響p8基因的轉(zhuǎn)錄;Luciferase實(shí)驗(yàn)證實(shí)上述3個(gè)片段在空間上形成的復(fù)合體能夠幾乎完全抑制p8基因的啟動(dòng)子的活性，具有下調(diào)子的功能。
　　結(jié)論:通過本研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)p8表達(dá)能夠顯著影響非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞自噬的發(fā)生發(fā)展;同時(shí)也發(fā)現(xiàn)乙?；图谆缺碛^遺傳修飾