轉(zhuǎn)錄輔助因子PC4在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其功能的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肺癌的死亡率在全球惡性腫瘤中居首位，成為惡性疾病中人類健康的頭號(hào)殺手，其中非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)約占85％。大多數(shù)NSCLC臨床確診時(shí)已經(jīng)處于復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的晚期階段。作為標(biāo)準(zhǔn)一線治療的含鉑兩藥聯(lián)合化療方案進(jìn)入一個(gè)平臺(tái)期，5年生存率只有10～15％。分子靶向治療為晚期NSCLC患者帶來(lái)了希望，分子靶標(biāo)的探索也成為近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究惡性腫瘤治療的熱點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄輔助因子PC4是一種進(jìn)化過(guò)程中高度保守的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白，廣泛存在于酵母、哺乳動(dòng)物和人類細(xì)

2、胞中。人類PC4是一個(gè)127aa組成的單鏈DNA結(jié)合蛋白，在基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、DNA損傷修復(fù)、染色體形成等過(guò)程中均能發(fā)揮調(diào)控作用。已報(bào)道的PC4功能研究主要集中在DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面，該基因更多新的生物學(xué)功能還有待進(jìn)一步研究，尤其是PC4在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用尚未完全闡明。
　　 本課題以NSCLC為研究對(duì)象，重點(diǎn)研究轉(zhuǎn)錄輔助因子PC4在NSCLC中的表達(dá)及其功能。通過(guò)RT-PCR、Western blot和免疫組化技術(shù)檢測(cè)

3、PC4在NSCLC臨床樣本中的表達(dá)特點(diǎn)，探討其在NSCLC發(fā)生發(fā)展中的作用和意義；進(jìn)一步通過(guò)Western blot篩選高表達(dá)PC4的NSCLC細(xì)胞株建立體外研究模型，采用RNA干擾技術(shù)下調(diào)PC4表達(dá)，檢測(cè)NSCLC細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞代謝的變化特點(diǎn)，揭示其在NSCLC細(xì)胞中的功能及其作用機(jī)制；進(jìn)而建立NSCLC細(xì)胞裸鼠移植瘤模型，采用PC4特異性siRNA混合脂質(zhì)體瘤內(nèi)注射，明確其對(duì)NSCLC細(xì)胞移植瘤生長(zhǎng)的調(diào)控作用。此

4、外，初步研究PC4在大鼠骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)體外衰老過(guò)程中表達(dá)的變化特點(diǎn)，探討其在MSCs增殖和衰老中的調(diào)控作用。
　　 主要研究結(jié)果如下：
　　 1.對(duì)6例手術(shù)切除的NSCLC樣品，通過(guò)RT-PCR和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PC4在NSCLC癌組織中的表達(dá)水平高于NSCLC癌旁組織。進(jìn)一步收集104例NSCLC癌組織及癌旁組織的臨床標(biāo)本，通過(guò)免疫組化檢測(cè)證實(shí)PC4在NSCLC癌組織中表達(dá)上調(diào)，且

5、表達(dá)水平與NSCLC惡性程度及轉(zhuǎn)移情況具有相關(guān)性，惡性程度越高的NSCLC中PC4的表達(dá)水平越高，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況下NSCLC中PC4的表達(dá)水平高于無(wú)轉(zhuǎn)移情況下NSCLC。
　　 2.對(duì)7種不同組織學(xué)類型的肺癌相關(guān)細(xì)胞株，通過(guò)Western blot篩選PC4高表達(dá)NSCLC細(xì)胞株，并建立A549、H460、H358三種細(xì)胞的體外研究模型。進(jìn)一步通過(guò)RNAi下調(diào)PC4表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，三種細(xì)胞增殖均受到抑制，細(xì)胞周期G1期阻

6、滯，S期減少，同時(shí)發(fā)生不同程度的凋亡，以A549細(xì)胞凋亡效應(yīng)最明顯，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)A549細(xì)胞線粒體膜電位、細(xì)胞內(nèi)活性氧濃度、細(xì)胞內(nèi)ATP濃度均明顯降低，Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PCNA、Cyclin D1表達(dá)下調(diào)，p21表達(dá)上調(diào)，casepase-3表達(dá)被激活，PARP表達(dá)被剪切。
　　 3.建立A549細(xì)胞裸鼠移植瘤模型，采用PC4特異性siRNA混合脂質(zhì)體治療后發(fā)現(xiàn)，腫瘤生長(zhǎng)受到抑制，腫瘤平均重量明顯降低，鏡下

7、可見(jiàn)明顯的腫瘤細(xì)胞壞死區(qū)，血管形成減少，Ki67表達(dá)降低，凋亡細(xì)胞增加，裸鼠平均體質(zhì)量及主要臟器組織的鏡下形態(tài)未發(fā)生明顯的變化。
　　 4.大鼠骨髓來(lái)源的MSCs長(zhǎng)期體外連續(xù)傳代后出現(xiàn)細(xì)胞衰老，PC4在衰老細(xì)胞中表達(dá)降低。通過(guò)RNAi下調(diào)PC4表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，MSCs增殖受到抑制，β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性率增加。
　　 取得的主要結(jié)論包括：
　　 1.PC4在NSCLC中呈過(guò)表達(dá)狀態(tài)，可能在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移

8、中發(fā)揮作用，為NSCLC分子病理診斷提供了潛在的候選分子標(biāo)志。
　　 2.下調(diào)PC4表達(dá)可抑制NSCLC細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞代謝水平降低，表明PC4在NSCLC細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞代謝的調(diào)控中發(fā)揮作用。
　　 3.PC4特異性siRNA混合脂質(zhì)體治療可抑制NSCLC細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)，且無(wú)明顯的毒副作用。體外和體內(nèi)研究表明，PC4可能是NSCLC分子靶向治療的新的潛在靶點(diǎn)。