結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)在BMP9誘導(dǎo)的成骨分化及在腫瘤發(fā)生過(guò)程中的作用.pdf

1、本課題的主要研究目的是揭示結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF，又稱CCN2）在骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）9誘導(dǎo)的成骨分化，以及CTGF在骨腫瘤發(fā)生中的作用。
　　 CCN蛋白家族含有6個(gè)成員，為CCN1到CCN6，它們均為富含半胱氨酸的分泌性小分量蛋白。CCN蛋白是含有四個(gè)功能性結(jié)構(gòu)域的modular蛋白。多數(shù)CCN蛋白家族的成員受生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子或細(xì)胞壓力的誘導(dǎo)調(diào)控。CCN蛋白在成體和胚胎組織的表達(dá)模式廣泛且差異很大。CCN蛋白可以通

2、過(guò)參與并調(diào)節(jié)多種信號(hào)分子而發(fā)揮作用，如整合素、BMPs、血管內(nèi)盤(pán)生長(zhǎng)因子（VEGF）、Wnts和Notch等。其中，整合素介導(dǎo)的CCN信號(hào)傳遞具有組織和細(xì)胞特異性，根據(jù)細(xì)胞外基質(zhì)不同而作用各異。
　　 在本課題中，我們首先檢測(cè)了CCN蛋白家族中最重要的4個(gè)成員，CCN1、CCN2、CCN3和CCN4，對(duì)BMP9誘導(dǎo)的成骨分化和對(duì)骨肉瘤的作用。結(jié)果顯示CCN2（CTGF）抑制了BMP9誘導(dǎo)的成骨分化，促進(jìn)了骨肉瘤細(xì)胞株143B的增

3、殖和遷移，兩個(gè)方面均具有顯著性差異。于是，我們選擇CTGF做進(jìn)一步深入研究。為了方便表述，本課題大致分為兩部分：
　　 第一部分：CTGF在BMP9誘導(dǎo)的成骨分化中的作用
　　 在第一節(jié)，我們從孕12.5到13.5天的小鼠胚胎中分離得到了小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEFs）。進(jìn)而，我們用攜帶SV40T基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染MEFs，通過(guò)抗生素篩選，得到了永生化的MEFs（iMEFs）。iMEFs細(xì)胞株的建立為研究CTGF在BMP

4、9誘導(dǎo)的成骨分化和在骨肉瘤細(xì)胞中的作用奠定了基礎(chǔ)。
　　 在第二節(jié)中，我們?cè)u(píng)價(jià)了4中CCN蛋白，CCN1、CCN2、CCN3和CCN4，對(duì)BMP9誘導(dǎo)的成骨分化的影響。處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的iMEFs共感染AdBMP9和AdR-CCN1、Ad-CCN2、Ad-CCN3、Ad-CCN4或AdGFP重組腺病毒。在7天后成骨分化早期標(biāo)志堿性磷酸酶（ALP）用比色發(fā)定量測(cè)定。結(jié)果顯示CCN2（CTGF）具有最強(qiáng)的抑制BMP9誘導(dǎo)的骨形成的能力

5、。這一結(jié)果促使我們選擇CTGF做進(jìn)一步深入研究。
　　 由于CTGF是一種含有4個(gè)結(jié)構(gòu)域的mosaic蛋白，為進(jìn)一步研究哪個(gè)或哪幾個(gè)結(jié)構(gòu)域發(fā)揮著抑制作用，在第三節(jié)里我們構(gòu)建了CTGF的中間缺失和C末端缺失突變體。利用分子生物學(xué)技術(shù)，我們構(gòu)建了一系列克隆，最終制作了6種重組腺病毒，它們分別表達(dá)CTGF全長(zhǎng)、CTGFCD1（無(wú)結(jié)構(gòu)域Ⅳ），CTGFCD2（無(wú)結(jié)構(gòu)域Ⅲ和Ⅳ），CTGFID1（無(wú)結(jié)構(gòu)域Ⅱ），CTGFID2（無(wú)結(jié)構(gòu)域Ⅲ）和C

6、TGFID3（無(wú)結(jié)構(gòu)域Ⅱ和Ⅲ）。6種腺病毒經(jīng)蛋白酶K裂解，以基因組DNA為模板做PCR，鑒定了CTGF全長(zhǎng)及其突變體的存在。以抗Flag抗體為一抗做Western blon，證實(shí)了6種腺病毒可以成功表達(dá)CTGF全長(zhǎng)及其突變體（CTGF及其突變體均與3×Flag標(biāo)簽融合表達(dá)。CTGF全長(zhǎng)和缺失突變體重組腺病毒的成功構(gòu)建，為進(jìn)一步解析在成骨分化中發(fā)揮功能的結(jié)構(gòu)域奠定了基礎(chǔ)。
　　 在第四節(jié)，我們檢測(cè)了CTGF全長(zhǎng)及其缺失突變體對(duì)BM

7、P9誘導(dǎo)的成骨分化的體外影響。用AdBMP9和CTGF腺病毒（AdR-CTGF，CTGFCD1，CTGFCD2，CTGFID1，CTGFID2，CTGFID3）聯(lián)合感染出于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的iMEFs細(xì)胞，以AdBMP9+AdRFP感染作為對(duì)照組。感染7天后檢測(cè)成骨早期指標(biāo)ALP的活性（組織染色）。結(jié)果顯示CTGF全長(zhǎng)、CTGFCD1和CTGFCD2能夠抑制BMP9誘導(dǎo)的成骨分化，而CTGFID1、CTGFID2和CTGFID3的抑制效果更為

8、顯著。
　　 在第五節(jié)中，我們檢測(cè)了CTGF全長(zhǎng)及其突變體對(duì)BMP9誘導(dǎo)的骨形成的體內(nèi)作用。感染BMP9+RFP或BMP9+CTGF突變體腺病毒的iMEFs細(xì)胞種植于裸鼠皮下。皮下成骨包塊在6周后收獲。用Micro-CT、HE染色和Masson’s Trichrome染色分析皮下成骨包塊的大體和細(xì)節(jié)信息結(jié)果顯示，與BMP9+RFP對(duì)照組相比，BMP+CTGFCD2和BMP9+CTGFCD1感染得到的包塊體積明顯增大，而B(niǎo)MP+C

9、TGFID1/2/3組得到的包塊體積明顯小于對(duì)照組。BMP9+CTGF全長(zhǎng)組似乎對(duì)包塊體積無(wú)明顯影響。組織學(xué)分析顯示，CTGF缺失突變體通過(guò)促進(jìn)或抑制iMEFs細(xì)胞的增殖而影響B(tài)MP9誘導(dǎo)的成骨作用。然而，CTGF及其突變體并沒(méi)有影響B(tài)MP9誘導(dǎo)的iMEFs分化。
　　 第二部分：CTGF在腫瘤發(fā)生過(guò)程中的作用
　　 在本部分的第一節(jié)中，我們利用結(jié)晶紫染色和劃痕試驗(yàn)，研究了CCN1、CCN2、CCN3和CCN4對(duì)骨肉瘤細(xì)

10、胞株143B和MG63的生長(zhǎng)和遷移作用。結(jié)果顯示CCN1和CCN2可促進(jìn)143B細(xì)胞的增殖和MG63細(xì)胞的遷移，而CCN3和CCN4對(duì)這些骨肉瘤細(xì)胞株的增殖和遷移沒(méi)有明顯的促進(jìn)作用，甚至有輕微的抑制作用?？紤]到我們?cè)诘谝徊糠诌x擇了CCN2（CTGF）做深入研究，在第二部分，我們同樣選擇CCN2（CTGF）做進(jìn)一步深入研究，即體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。
　　 在第二節(jié)中，我們利用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染和抗生素篩選的方法，制作了兩種穩(wěn)定整合和表達(dá)熒光素酶基

11、因的骨肉瘤細(xì)胞株143B-Luc和MG63-Luc，并用熒光素活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)體外測(cè)定了兩個(gè)細(xì)胞株的功能。143B-Luc和MG63-Luc細(xì)胞的熒光素酶活性均超過(guò)1，000，000，而對(duì)照組143B和MG63細(xì)胞的熒光素酶活性均低于100。143B-Luc和MG63-Luc細(xì)胞株的成功構(gòu)建為研究CTGF的體內(nèi)功能奠定了基礎(chǔ)。
　　 在第三節(jié)，我們檢測(cè)了CTGF腺病毒直接感染對(duì)143B-Luc骨肉瘤細(xì)胞體內(nèi)作用。143B-Luc細(xì)胞

12、感染Ad-CTGF或Ad-GFP腺病毒18小時(shí)后，注射到裸鼠背部皮下，用Xenogen活體成像技術(shù)跟蹤腫瘤的生長(zhǎng)情況，注射后32天處死裸鼠，收獲腫瘤。結(jié)果顯示，CTGF組的腫瘤包塊體積顯著大于GFP對(duì)照組的包塊體積，說(shuō)明CTGF更夠促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的體內(nèi)生長(zhǎng)。
　　 在第四節(jié)，我們利用iMEFs細(xì)胞作為CTGF基因的遞送載體，檢測(cè)了CTGF對(duì)MG63-Luc細(xì)胞的體內(nèi)作用。iMEFs分別用Ad-CTGF或Ad-GFP感染18小時(shí)，

13、感染后的iMEFs細(xì)胞與MG63-Luc細(xì)胞按照1：1的細(xì)胞比例混合，總細(xì)胞數(shù)為2×106，注射到裸鼠背部皮下。不與iMEFS細(xì)胞混合的單獨(dú)的MG63-Luc細(xì)胞作為對(duì)照組。用Xenogen活體成像技術(shù)跟蹤腫瘤的生長(zhǎng)情況，注射后25天處死裸鼠，收獲腫瘤包塊。結(jié)果顯示，iMEFs+CTGF組的腫瘤包塊體積遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于iMEFs+GFP對(duì)照組。iMEFs+GFP對(duì)照組與不與iMEFS細(xì)胞混合的單獨(dú)的MG63-Luc細(xì)胞作為對(duì)照組相比，所得包塊體

14、積無(wú)明顯差別。說(shuō)明CTGF可促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，且iMEFs細(xì)胞可作為有效的基因遞送載體。
　　 總之，我們的研究結(jié)果顯示，CTGF的結(jié)構(gòu)域Ⅳ可對(duì)BMP9誘導(dǎo)的體內(nèi)成骨有抑制作用，而結(jié)構(gòu)域Ⅰ可促進(jìn)這種成骨。我們的研究結(jié)果還顯示CTGF能促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的體內(nèi)和體外增殖。另外，表達(dá)CTGF的iMEFs細(xì)胞顯著地促進(jìn)了骨肉瘤的體內(nèi)生長(zhǎng)，提示CTGF的功能與其所處的細(xì)胞外微環(huán)境密切相關(guān)。
　　 最終，我們的結(jié)果將為BMP9和C