結(jié)締組織生長因子VHH納米抗體庫的構(gòu)建、篩選及在脂多糖誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷中作用的研究.pdf

1、研究背景：
　　重鏈抗體(Heavy-chain antibodies，HCAbs)是一種新型的抗體類別，該類抗體缺失輕鏈和抗體CH1恒定區(qū)，僅由重鏈構(gòu)成;其重鏈可變區(qū)(Variable domain of the H chain of Heavy Chain Antibody,VHH)的單一結(jié)構(gòu)域構(gòu)成了這類抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)，打破了重鏈和輕鏈共同構(gòu)成抗體-抗原結(jié)合域的規(guī)則，盡管缺失輕鏈可變區(qū)，但仍具有完全的抗原結(jié)合力。自1993

2、年Hamers發(fā)現(xiàn)單峰駝血清中天然存在重鏈抗體以來，研究者在全部駱駝科動(dòng)物如單峰駝、雙峰駝、羊駝等體內(nèi)均證實(shí)了這類抗體的存在。利用基因工程技術(shù)克隆重鏈抗體的可變區(qū)可獲得VHH抗體，也稱為納米抗體(Nanobody)。VHH納米抗體是目前所發(fā)現(xiàn)的具有完整功能的最小分子抗體片段，分子量約為15kDa，僅為常規(guī)抗體的1/10。VHH納米抗體具有分子量小、可溶性強(qiáng)、穩(wěn)定性高、易于克隆篩選及人源化改造等獨(dú)特優(yōu)勢，對疾病的診斷和治療等方面具有重要的

3、意義。
　　在前期研究中，通過噬菌體展示技術(shù)獲得了人源抗CTGF單鏈抗體Anti-CTGF scFv(Genbank Access NO.GQ390339);實(shí)驗(yàn)研究顯示Anti-CTGF scFv能夠抑制肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)換，并對博來霉素所致小鼠肺纖維化具有一定的抑制作用。前期Anti-CTGF scFv的研究為本研究提供了一定的基礎(chǔ)，但肺纖維化疾病是多種病因引起的肺部破壞性疾病的終末期階段，一般認(rèn)為肺纖維化病程

4、不可逆轉(zhuǎn)且以早期肺炎癥及肺損傷為特征，因此，在肺部病變改變的早期階段進(jìn)行藥物干預(yù)或治療具有更好的治療效果。
　　研究目的：
　　構(gòu)建結(jié)締組織生長因子VHH納米抗體文庫，篩選獲取CTGF特異性的VHH納米抗體;通過基因工程的方法表達(dá)制備高純度的CTGF VHH納米抗體;研究其在脂多糖誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷中的作用，初步建立新一代基因工程抗體片段即VHH納米抗體的研究方法，為進(jìn)一步探索其臨床價(jià)值提供依據(jù)。
　　研究方法：

5、>　　1.重組結(jié)締組織生長因子C端(CT)抗原的制備:構(gòu)建CTGF-C端(CT)原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliBL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，經(jīng)鎳親和層析、腸激酶酶切等步驟制備目的蛋白CTGF-C端(CT)，并進(jìn)行SDS-PAGE、ELISA和Western Blot分析;CCK-8和Transwell實(shí)驗(yàn)考察其在細(xì)胞增殖和遷移中的活性。2.結(jié)締組織生長因子VHH納米抗體文庫的構(gòu)建:CTGF-C端(CT)蛋白免疫雙

6、峰駝，RT-PCR獲得全套雙峰駝VHH抗體基因，將其克隆到噬菌體載體并與編碼噬菌體衣殼蛋白的基因相連接，展示于噬菌體表面，構(gòu)建雙峰駝VHH納米抗體文庫。3.CTGF特異性VHH納米抗體的生物淘選:采用親和淘選技術(shù)，包被純化的重組抗原CTGF-C端(CT)，進(jìn)行“吸附-洗脫-擴(kuò)增”的生物淘選，逐輪改變抗原包被濃度和洗滌壓力，富集特異性結(jié)合CTGF-C端(CT)的噬菌體，從而篩選獲得CTGF特異性VHH納米抗體。4.CTGF VHH納米抗體

7、的表達(dá)純化與活性的初步研究:構(gòu)建VHH納米抗體表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliBL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，經(jīng)鎳親和層析純化制備VHH納米抗體并檢測其活性。5.CTGFVHH納米抗體在脂多糖誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷中作用的研究:氣管內(nèi)注射LPS誘導(dǎo)建立小鼠急性肺損傷模型(ALI)，CTGFVHH納米抗體干預(yù)ALI，給藥24h和48h處死動(dòng)物，分離肺部組織并收集肺泡灌洗液，觀察肺組織病理改變、肺泡灌洗液細(xì)胞分類計(jì)數(shù)等指標(biāo)，初步

8、探討CTGFVHH納米抗體在LPS所致小鼠急性肺損傷中的作用。
　　研究結(jié)果：
　　1.重組結(jié)締組織生長因子C端(CT)抗原的制備:融合蛋白TrxA-His-CTGF-C在BL21(DE3)主要以可溶性形式表達(dá)，分離純化獲得了純度大于95％的CTGF-C端(CT)蛋白。ELISA和Western Blot分析顯示其與Anti-CTGF具有良好的結(jié)合活性。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，一定濃度的純化CTGF-C端(CT)蛋白，可以促進(jìn)人臍靜脈

9、內(nèi)皮細(xì)胞和人近曲腎小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞增殖和遷移。免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示，分離純化所獲目的蛋白CTGF-C端(CT)具有良好的生物活性，能夠滿足后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)需求。2.結(jié)締組織生長因子VHH納米抗體文庫的構(gòu)建:免疫后雙峰駝血清中抗CTGF抗體滴度水平達(dá)1∶128，000;瓊脂糖凝膠電泳顯示，巢式PCR第二輪產(chǎn)物在約400bp處有特異性條帶，大小與VHH基因一致;將VHH基因片段用限制性內(nèi)切酶NcoⅠ-HF和NotⅠ-HF消化后與噬菌粒載

10、體pHEN2連接，電轉(zhuǎn)化XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)板陽性克隆子計(jì)數(shù)約為1.6×109，PCR鑒定VHH基因片段的插入率為93％，所構(gòu)建VHH抗體庫庫容量為1.49×109CFU;隨機(jī)挑取20個(gè)陽性克隆，測序結(jié)果均不相同，顯示所構(gòu)建VHH抗體庫具有良好的多樣性。3.CTGF特異性VHH抗體的生物淘選:測序結(jié)果顯示，12個(gè)克隆測序中，其中9個(gè)克隆展示的核苷酸序列完全相同，轉(zhuǎn)化為氨基酸序列后，命名為Nb1，即CTGF特異性納米抗體(Ge

11、nBank Access:NO.KX428017)。4.CTGF VHH納米抗體的表達(dá)純化與活性的初步研究:VHH納米抗體在大腸桿菌以可溶性的形式表達(dá)，經(jīng)鎳親和層析純化獲得該抗體純度大于95％;ELISA實(shí)驗(yàn)表明，該抗體能和CTGF-C端(CT)特異性結(jié)合并具有較高的親和力;且該抗體能夠抑制CTGF-C端(CT)引起的促BEAS-2B、MRC-5和HLEF細(xì)胞的細(xì)胞增殖活性。5.CTGF VHH納米抗體在脂多糖誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷中作用的

12、研究:氣管內(nèi)注射LPS后成功建立小鼠急性肺損傷模型，肺組織切片HE染色和Masson染色顯示，該模型具有典型的肺泡結(jié)構(gòu)的受損、萎縮甚至結(jié)構(gòu)消失，肺組織內(nèi)可見大量彌漫性炎性細(xì)胞的浸潤等特征;在給予VHH納米抗體干預(yù)后小鼠肺泡及間質(zhì)炎癥均明顯減輕;肺泡灌洗液中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)較LPS模型組明顯降低（P＜0.05);同時(shí)，CTGF VHH納米抗體明顯降低了小鼠BALF和血清中TNF-α及IL-1β水平;與LPS模型組比較，VHH納米抗體治療組小鼠

13、肺組織p65蛋白表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05)，但未觀察到磷酸化p65蛋白表達(dá)水平的明顯改變。
　　研究結(jié)論：
　　成功構(gòu)建了庫容量較高、基因多樣性良好的噬菌體展示VHH納米抗體文庫;生物淘選獲得CTGF特異性VHH納米抗體;該抗體能夠抑制CTGF-C端(CT)引起的促BEAS-2B、MRC-5和HLEF細(xì)胞的細(xì)胞增殖活性，并且能夠LPS所致小鼠急性肺損傷中炎癥和損傷程度，其分子機(jī)制可能與降低P65表達(dá)水平，抑制NF-κB