EGFR信號(hào)通路通過 Egr2促進(jìn)骨祖細(xì)胞增殖并抑制骨祖細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)性研究.pdf

1、骨組織結(jié)構(gòu)完整性的維持依賴于骨祖細(xì)胞池中成骨細(xì)胞的不斷更新,該生物學(xué)過程由許多生長(zhǎng)因子進(jìn)行精細(xì)調(diào)控。表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)配體是目前已知的骨祖細(xì)胞有絲分裂原。但這些配體調(diào)節(jié)骨祖細(xì)胞池的具體機(jī)制沒有得到詳細(xì)闡述,尤其是EGFR信號(hào)通路在調(diào)節(jié)骨祖細(xì)胞凋亡中的作用沒有得到詳細(xì)研究。在本研究中,證實(shí)了EGFR信號(hào)通路的激活通過促進(jìn)骨祖細(xì)胞增殖并抑制骨祖細(xì)胞凋亡,增加骨祖細(xì)胞數(shù)量。該結(jié)論在大鼠顱骨組織器官培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中得到進(jìn)一步證實(shí)。在大鼠顱骨

2、組織器官培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中,表皮生長(zhǎng)因子(EGF)在增加增殖細(xì)胞數(shù)量的同時(shí),降低了凋亡細(xì)胞數(shù)量,從而增加成骨細(xì)胞總數(shù)量。骨祖細(xì)胞系 MC3T3細(xì)胞 Microarray分析提示,EGFR信號(hào)通路能誘導(dǎo)抗凋亡基因 Mcl1以及早期生長(zhǎng)反應(yīng)基因(Egr1,Egr2,Egr3)的表達(dá)。過表達(dá) Egrs的抑制蛋白 Nab2可抑制EGF誘導(dǎo)的骨祖細(xì)胞數(shù)量增加。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明,以 SiRNA降低 Egr2的表達(dá),可抑制EGF誘導(dǎo)的骨祖細(xì)胞數(shù)量增加,而以 S

3、iRNA降低 Egr1、Egr3的表達(dá),則對(duì) EGF誘導(dǎo)的骨祖細(xì)胞數(shù)量增加沒有影響。進(jìn)一步研究證實(shí) Egr2是 EGF促進(jìn)骨祖細(xì)胞增殖并抑制骨祖細(xì)胞凋亡的主要介導(dǎo)基因。采用腺病毒過表達(dá)、抑制劑以及SiRNA等實(shí)驗(yàn)方法,我們證實(shí)了EGFR信號(hào)通路激活 MAPK/Erk通路,進(jìn)而誘導(dǎo) Egr2的表達(dá),從而導(dǎo)致了Mcl1的增加,最終抑制細(xì)胞凋亡。同時(shí),另一骨祖細(xì)胞有絲分裂原和存活因子成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)2,也能通過誘導(dǎo) Egr2的表達(dá)

4、,進(jìn)而促進(jìn)骨祖細(xì)胞增殖,抑制骨祖細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果表明,Egr2在生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的骨祖細(xì)胞數(shù)量增加中起著重要作用?？偟膩碚f,實(shí)驗(yàn)結(jié)果清楚地說明了EGFR信號(hào)傳導(dǎo)通路,通過誘導(dǎo) Egr2的表達(dá),促進(jìn)骨祖細(xì)胞增殖,抑制骨祖細(xì)胞凋亡,進(jìn)而在調(diào)節(jié)骨祖細(xì)胞庫的生物學(xué)功能中,起著重要的作用。
　　本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分 EGFR信號(hào)通路促進(jìn)骨祖細(xì)胞增殖并抑制骨祖細(xì)胞凋亡
　　目的:檢測(cè) EGFR信號(hào)通路對(duì)骨祖

5、細(xì)胞增殖和凋亡的影響。
　　方法:將成骨細(xì)胞系MC3T3細(xì)胞或大鼠原代顱骨成骨細(xì)胞培養(yǎng)于含0.5％FBS培養(yǎng)基內(nèi),分別給予EGFR配體(實(shí)驗(yàn)組)或等體積EGFR配體溶解液(對(duì)照組),以細(xì)胞計(jì)數(shù)法連續(xù)檢測(cè)MC3T3細(xì)胞總數(shù)。同時(shí),以BrdU法檢測(cè)MC3T3細(xì)胞或大鼠原代顱骨成骨細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中的增殖情況,并以EB/AO染色法檢測(cè)在血清剝奪及TNFα誘導(dǎo)時(shí),這兩組中MC3T3細(xì)胞或大鼠原代顱骨成骨細(xì)胞的細(xì)胞凋亡情況。同時(shí),分別以

6、EGFR特異性抑制劑吉非替尼(Gefitinib,GEF)、MEK1/2信號(hào)傳導(dǎo)途徑特異性抑制劑U0126、PI3K信號(hào)傳導(dǎo)途徑特異性抑制劑喔曼青霉素(Wortmannin,WM)以及p38信號(hào)傳導(dǎo)途徑抑制劑SB預(yù)處理細(xì)胞,初步探討EGFR信號(hào)通路影響骨祖細(xì)胞增殖和凋亡的機(jī)制。與此同時(shí),取第五代骨祖細(xì)胞/成骨細(xì)胞特異性EGFR敲除小鼠(3.6kb collagen1a1-Cre EgfrWa5/flox小鼠)及其野生型同科小鼠原代骨髓間

7、質(zhì)干細(xì)胞,以流式細(xì)胞學(xué)(Flow Cytometry)分析其細(xì)胞特性,并以EB/AO染色法檢測(cè)EGF對(duì)血清剝奪或TNFα誘導(dǎo)的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞凋亡的影響。
　　結(jié)果:細(xì)胞計(jì)數(shù)法結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組中MC3T3細(xì)胞或大鼠原代顱骨成骨細(xì)胞總數(shù)明顯增加。BrdU法檢測(cè)顯示,實(shí)驗(yàn)組中增殖 MC3T3細(xì)胞或大鼠原代顱骨成骨細(xì)胞的數(shù)量顯著高于對(duì)照組。同時(shí),EB/AO染色法結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組中血清剝奪或 TNFα誘導(dǎo)的MC3T3細(xì)胞或大鼠

8、原代顱骨成骨細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組顯著減少。抑制劑實(shí)驗(yàn)顯示,EGF促進(jìn)細(xì)胞增殖依賴于 MAPK/Erk和PI3K/Akt兩條信號(hào)傳導(dǎo)途徑,而EGF抑制血清剝奪或 TNFα誘導(dǎo)的MC3T3細(xì)胞或大鼠原代顱骨成骨細(xì)胞凋亡僅依賴于 MAPK/Erk信號(hào)傳導(dǎo)途徑而不依賴于 PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)途徑。流式細(xì)胞學(xué)分析顯示,第五代骨祖細(xì)胞/成骨細(xì)胞特異性 EGFR敲除小鼠(3.6kb collagen1a1-Cre EgfrWa5/flox小鼠

9、)及其野生型同科小鼠原代骨髓間質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞表面表達(dá)有干細(xì)胞標(biāo)志物(Sca1+CD29+CD45-)。EB/AO染色顯示,在野生型小鼠原代骨髓間質(zhì)干細(xì)胞中,EGF對(duì)血清剝奪或 TNFα誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有抑制作用,而在骨祖細(xì)胞/成骨細(xì)胞特異性 EGFR敲除小鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞中,EGF對(duì)血清剝奪或 TNFα誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡沒有影響。
　　結(jié)論:EGFR信號(hào)通路可以促進(jìn)骨祖細(xì)胞增殖,抑制骨祖細(xì)胞凋亡。其促進(jìn)骨祖細(xì)胞增殖機(jī)制依賴于 MAPK/E

10、rk和PI3K/Akt兩條信號(hào)傳導(dǎo)途徑,而抑制骨祖細(xì)胞凋亡機(jī)制僅依賴于 MAPK/Erk信號(hào)傳導(dǎo)途徑。
　　第二部分 EGFR信號(hào)通路促進(jìn)顱蓋骨組織器官內(nèi)成骨細(xì)胞系細(xì)胞增殖并抑制其凋亡
　　目的:探討 EGFR對(duì)顱蓋骨組織器官內(nèi)成骨細(xì)胞系細(xì)胞增殖和凋亡的影響。
　　方法:將新生小鼠顱蓋骨組織器官分別于含有10％FBS的生長(zhǎng)培養(yǎng)基(FBS組)、含或等體積EGF溶劑(1mg/ml BSA in1 mM Acetic Aci

11、d)無FBS生長(zhǎng)培養(yǎng)基(對(duì)照組)和含有50ng/ml EGF的無FBS生長(zhǎng)培養(yǎng)基(實(shí)驗(yàn)組)內(nèi)培養(yǎng)7天。經(jīng)脫鈣處理后,將標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋并切片。行蘇木精伊紅(Hematoxylin&Eosin, H&E)染色,檢測(cè)器內(nèi)成骨細(xì)胞數(shù)量。同時(shí),行Ki67、TUNEL、TRAP免疫組化染色,以檢測(cè)組織內(nèi)增殖細(xì)胞、凋亡細(xì)胞以及破骨細(xì)胞數(shù)量。
　　結(jié)果:培養(yǎng)7天后,在FBS組中,顱蓋骨組織器官可見較多成骨細(xì)胞,且顱蓋骨形態(tài)良好。在對(duì)照組中,可見

12、顱蓋骨組織器官中的成骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少,顱蓋骨厚度變薄,形態(tài)較差。在EGF組內(nèi),可見大量成骨細(xì)胞,其成骨細(xì)胞含量甚至高于FBS組,且該處理組顱蓋骨較厚,形態(tài)良好。EGF組中成骨細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組相比,有明顯差異。Ki67免疫組化染色顯示,EGF組內(nèi),顱蓋骨組織的增殖細(xì)胞數(shù)顯著高于對(duì)照組組。同時(shí),TUNEL免疫組化染色結(jié)果顯示,EGF能顯著降低顱蓋骨組織中凋亡細(xì)胞的數(shù)量。此外,破骨細(xì)胞TRAP染色提示,EGF還可維持顱蓋骨組織中破骨細(xì)胞數(shù)量

13、。
　　結(jié)論:在顱蓋骨組織器官培養(yǎng)中,EGFR信號(hào)通路可以促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖,抑制其凋亡,同時(shí),對(duì)維持破骨細(xì)胞數(shù)量也有重要作用。
　　第三部分 EGFR信號(hào)通路通過 MAPK/Erk/Egr2信號(hào)傳導(dǎo)途徑介導(dǎo)凋亡
　　目的:探討 EGF促進(jìn)骨祖細(xì)胞增殖并抑制骨祖細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制。
　　方法:以50ng/ml EGF刺激 MC3T3細(xì)胞,并收集1小時(shí)、4小時(shí)和24小時(shí) RNA標(biāo)本進(jìn)行微陣列分析(Microarray

14、 Analysis),尋找 EGF調(diào)節(jié)的凋亡相關(guān)基因以及EGF上調(diào)最多的基因。再以 qRT-PCR,Western Blotting檢測(cè)這些基因的mRNA及蛋白表達(dá)。同時(shí),應(yīng)用SiRNA技術(shù)以及腺病毒過表達(dá)技術(shù),研究這些基因在骨祖細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)效應(yīng)。
　　結(jié)果:微陣列分析顯示,Mcl1是唯一受 EGF調(diào)節(jié)的凋亡相關(guān)基因。EGF可誘導(dǎo) Mcl1 mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)。該表達(dá)可被 EGFR特異性抑制劑吉非替尼(Gefitini

15、b, GEF)和MAPK/Erk信號(hào)傳導(dǎo)途徑特異性抑制劑 U0126所抑制。EGR1,2和3是 EGF刺激后骨祖細(xì)胞內(nèi) mRNA水平表達(dá)增強(qiáng)的一組即早反應(yīng)基因。EGF可誘導(dǎo) EGRs mRNA水平和蛋白水平的表達(dá),其表達(dá)峰值在30分鐘至1小時(shí)。EGF誘導(dǎo) EGRs表達(dá)也可被 EGFR特異性抑制劑吉非替尼(Gefitinib)和MAPK/Erk信號(hào)傳導(dǎo)途徑特異性抑制劑 U0126所抑制。過表達(dá) Egrs轉(zhuǎn)錄共抑制因子 Nab2或以 SiR