調(diào)節(jié)RAGE表達(dá)促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞衰老的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化是動(dòng)脈的一種炎性、退行性和增生性病變，其病理生理基礎(chǔ)在于血管損傷后新生內(nèi)膜過(guò)度增殖及內(nèi)皮功能不全。EPCs是一類能增殖并分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，但尚未表達(dá)成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞表型，也未形成血管的前體細(xì)胞。EPCs不僅參與血管形成(angiogenesis)，同時(shí)也參與出生后血管生成(vasculogenesis)和損傷血管內(nèi)皮功能的修復(fù)，在防治動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演重要角色。骨髓EPC雖屬于早期細(xì)胞，其功能和潛質(zhì)仍不可避免的

2、受到遺傳和機(jī)體環(huán)境的影響，會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞衰老的表現(xiàn)[1、2]，不僅修復(fù)損傷血管內(nèi)膜防治動(dòng)脈粥樣硬化的能力下降，甚至?xí)?dǎo)致血管損傷后新生內(nèi)膜過(guò)度增殖，內(nèi)皮功能紊亂，促使動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[3，4]。了解影響EPCs衰老因素，明確其影響EPCs活性途徑，提高EPCs功能活性，對(duì)防治動(dòng)脈粥樣硬化將產(chǎn)生積極的影響。 晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)是蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或核酸等大分子

3、與葡萄糖或其它還原單糖通過(guò)非酶糖基化反應(yīng)生成的穩(wěn)定的共價(jià)化合物。血清AGEs水平在高齡、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病患者中顯著升[5、6]。血清AGEs濃度可作為機(jī)體衰老和動(dòng)脈粥樣硬化早期預(yù)測(cè)的生物學(xué)標(biāo)志[7-10]。AGEs與內(nèi)皮細(xì)胞表面的RAGE結(jié)合能促進(jìn)氧化應(yīng)激，激活NF-KB，增加血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)、組織因子的表達(dá)，增加內(nèi)皮細(xì)胞的滲透性，減少一氧化氮(NO)合成，促進(jìn)單核細(xì)胞的黏附和經(jīng)內(nèi)皮的遷移，提高促凝活性，促進(jìn)脂質(zhì)

4、的浸潤(rùn)[11-14]，這些在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用。在我們既往的研究中發(fā)現(xiàn)老齡大鼠的血清可以抑制年輕供體大鼠骨髓EPCs的活性，而使用年輕供體大鼠的血清則可以提高老齡供體大鼠骨髓EPCs活性，說(shuō)明老齡大鼠血清中某些成分可以抑制EPCs功能。我們也發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化會(huì)導(dǎo)致EPCs數(shù)量減少、活性減退，且與動(dòng)脈粥樣硬化程度正相關(guān)[15]，認(rèn)為某些和動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的物質(zhì)可能影響EPCs功能導(dǎo)致EPCs衰老。Dernbach等[1

5、6]發(fā)現(xiàn)EPCs相對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞(EC)具有更低的ROS水平，EPCs修復(fù)損傷血管的能力與其較低的ROS水平有關(guān)，ROS水平升高，EPCs修復(fù)損傷血管的活性降低?；谝陨涎芯课覀?cè)O(shè)想AGEs通過(guò)RAGE調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激影響EPCs衰老，參與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過(guò)程。 本實(shí)驗(yàn)擬使用使用AGEs交聯(lián)阻斷劑ALT711治療，觀察ALT711治療對(duì)不同年齡大鼠骨髓EPCs功能的影響；體外培養(yǎng)骨髓EPCs，驗(yàn)證AGEs對(duì)EPCs生物學(xué)功能

6、的影響；調(diào)節(jié)EPCs表面RAGE的表達(dá)，研究RAGE表達(dá)改變對(duì)EPICs衰老的影響。 方法： 1、使用AGEs交聯(lián)阻斷劑ALT711治療，觀察ALT711治療對(duì)不同年齡大鼠骨髓EPCs功能的影響：3-4月齡、10-12月齡、18-20月齡SD雄性大鼠，隨機(jī)分為ALT711喂養(yǎng)組和對(duì)照組，從骨髓獲取單個(gè)核細(xì)胞并進(jìn)行體外培養(yǎng)、分化。培養(yǎng)7d后檢測(cè)各組EPCs遷移、黏附、增殖能力。提取不同年齡段大鼠血清，分為ALT711干預(yù)組

7、和對(duì)照組培養(yǎng)年輕大鼠骨髓EPCs，培養(yǎng)7d后檢測(cè)培養(yǎng)的各組EPCs遷移、黏附、增殖能力。探討供體年齡因素對(duì)骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的影響及ALT711對(duì)高齡供體骨髓EPCs的活化作用。 2、觀察不同濃度AGEs對(duì)EPCs活性的影響：3-4月齡SD雄性大鼠，從骨髓獲取單個(gè)核細(xì)胞并進(jìn)行體外培養(yǎng)、分化。培養(yǎng)7d后在EPCs中加入不同濃度AGEs，測(cè)定AGEs作用24h后EPCs內(nèi)活性氧、超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-

8、PX)含量，同時(shí)測(cè)定EPCs遷移、黏附、增殖能力。探討AGEs對(duì)骨髓EPCs活性的影響。 3、觀察CRP對(duì)EPCs活性的影響：3-4月齡SD雄性大鼠，從骨髓獲取單個(gè)核細(xì)胞并進(jìn)行體外培養(yǎng)、分化。培養(yǎng)7d后在EPCs中加入不同濃度CRP，測(cè)定CRP作用不同時(shí)間后EPCs遷移、黏附、增殖能力。探討CRP對(duì)骨髓EPCs活性的影響。 4、研究RAGE介導(dǎo)的氧化應(yīng)激對(duì)EPCs功能的影響及在EPCs衰老中的作用：使用不同濃度CRP刺激

9、EPCs，檢測(cè)CRP對(duì)RAGE的上調(diào)作用和對(duì)AGEs與RAGE結(jié)合的協(xié)同促進(jìn)效應(yīng)；使用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染siRNA到EPCs，檢測(cè)siRNA對(duì)RAGE的下調(diào)作用；檢測(cè)不同RAGE表達(dá)狀態(tài)下EPCs內(nèi)氧化應(yīng)激強(qiáng)弱；使用β半乳糖酐酶染色檢測(cè)EPCs衰老狀態(tài)。 5、研究阻斷RAGE表達(dá)對(duì)頸動(dòng)脈損傷模型的修復(fù)作用：建立頸動(dòng)脈損傷大鼠切脾模型并隨機(jī)分為對(duì)照組、高表達(dá)RAGE移植組和阻斷RAGE表達(dá)組進(jìn)行細(xì)胞移植，于細(xì)胞移植后14d，檢測(cè)各

10、族頸動(dòng)脈內(nèi)膜/中膜比、血管張力。 結(jié)果： 1、分離所得的單個(gè)核細(xì)胞初為圓形，培養(yǎng)3-5天后可觀察到少量梭形貼壁細(xì)胞，7-10天后出現(xiàn)大量梭形細(xì)胞，并可觀察到梭形細(xì)胞首尾相連形成條索狀結(jié)構(gòu)。用DiI-acLDL及FITC-UEA-I對(duì)細(xì)胞染色后，通過(guò)熒光顯微鏡觀察，染色雙陽(yáng)性細(xì)胞(黃色)為正在分化的EPCs。vWF免疫組化染色陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色； 2、將不同年齡組培養(yǎng)EPCs進(jìn)行遷移、黏附及增殖功能分析，結(jié)果提示隨供

11、體年齡的增長(zhǎng)，骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移、黏附、增殖等功能減退(P<0.01)，ALT711治療可部分恢復(fù)年齡相關(guān)骨髓EPCs活性；隨大鼠年齡增加其血清對(duì)骨髓EPCs活性具有抑制作用，加入ALT711干預(yù)可以拮抗這種效應(yīng)。 3、AGEs作用后EPCs內(nèi)活性氧含量明顯增加，超氧化物岐化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶等抗氧化酶含量減少，EPCs生物學(xué)功能明顯減退(P<0.01)。并且這種變化與AGEs濃度成正相關(guān)(P<0.01)。 4、C反

12、應(yīng)蛋白作用后骨髓EPCs遷移、黏附和增殖能力明顯減退。并且C反應(yīng)蛋白的這種作用成時(shí)間和濃度依賴性，隨作用時(shí)間延長(zhǎng)和/或濃度增加，EPCs功能明顯減退(P<0.01)。 5、使用不同濃度CRP刺激EPCs可以上調(diào)EPCs表面RAGE的表達(dá)，增強(qiáng)AGEs與RAGE結(jié)合，增強(qiáng)EPCs內(nèi)氧化應(yīng)激，促進(jìn)EPCs衰老(P<0.01)。使用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染siRNA阻斷RAGE可以削弱上訴作用(P<0.01)。 6、不同細(xì)胞移植對(duì)大

13、鼠頸動(dòng)脈修復(fù)有明顯差異，低RAGE表達(dá)組修復(fù)頸動(dòng)脈損傷程度明顯優(yōu)于高RAGE表達(dá)組(P<0.01)。 結(jié)論： 1、供體年齡對(duì)骨髓EPCs有影響，隨供體年齡增長(zhǎng)骨髓EPCs遷移、黏附、增殖等功能減退。ALT711干預(yù)可以改善供體增齡導(dǎo)致的EPCs活性減退，拮抗老年供體血清對(duì)EPCs活性的負(fù)性調(diào)節(jié)效應(yīng)； 2、AGEs促進(jìn)EPCs內(nèi)活性氧生成，減少抗氧化酶的合成，增強(qiáng)氧化應(yīng)激，破壞細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性，使細(xì)胞生物學(xué)功能受損