不同血管化策略構(gòu)建組織工程骨的研究.pdf

1、目的:
　　組織工程的發(fā)展為骨缺損的修復(fù)治療開辟了一條嶄新的道路。然而對(duì)于大型哺乳動(dòng)物大范圍或受區(qū)血供不佳的骨缺損，由于組織工程骨植入體內(nèi)后不能及時(shí)與機(jī)體建立有效血液循環(huán)，成骨效果不穩(wěn)定。組織工程骨的血管化成為目前骨組織工程的研究重點(diǎn)。目前構(gòu)建血管化組織工程骨的方法主要包括支架設(shè)計(jì)開發(fā)、應(yīng)用細(xì)胞因子、體外聯(lián)合內(nèi)皮祖細(xì)胞和體內(nèi)預(yù)血管化等。體外聯(lián)合內(nèi)皮祖細(xì)胞的方法在大動(dòng)物體內(nèi)研究較少;體內(nèi)預(yù)血管化的方法探討較多，但缺乏橫向比較。為此，

2、我們采用不同血管化策略在比格犬體內(nèi)構(gòu)建組織工程骨，明確體外聯(lián)合內(nèi)皮祖細(xì)胞的方法對(duì)組織工程骨成骨效果的影響，比較兩種體內(nèi)預(yù)血管化方法的成血管和促進(jìn)成骨作用，為臨床構(gòu)建血管化組織工程骨提供參考。
　　研究方法:
　　1.應(yīng)用密度梯度離心結(jié)合貼壁篩選法分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增比格犬BMSCs，并將BMSCs向骨、軟骨和脂肪方向誘導(dǎo)分化鑒定;應(yīng)用密度梯度離心法和差速貼壁法分離比格犬骨髓來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)，并進(jìn)行表面標(biāo)志和細(xì)胞功能鑒

3、定。
　　2.在體外構(gòu)建EPCs/BMSCs/TCP、EPCs/TCP、BMSCs/TCP細(xì)胞支架復(fù)合物，植入裸鼠皮下，分別在術(shù)后6周和12周取材，Micro-CT和組織學(xué)檢測各組的成骨能力。
　　3.在體外構(gòu)建EPCs/BMSCs/TCP和BMSCs/TCP細(xì)胞支架復(fù)合物，植入比格犬下肢肌肉袋內(nèi)，術(shù)后12周取材，Micro-CT、組織學(xué)和免疫組織化學(xué)檢測各組的成血管及成骨能力。
　　4.通過顯微外科的技術(shù)，吻合比格犬

4、下肢隱動(dòng)靜脈，形成動(dòng)靜脈環(huán)路(AVLoop)，構(gòu)建AV Loop血管化組織工程骨模型;同時(shí)采用比格犬隱動(dòng)靜脈遠(yuǎn)端結(jié)扎后置入細(xì)胞支架復(fù)合物內(nèi)，構(gòu)建血管束置入(Vascular bundle，VB)血管化組織工程骨模型;在術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)通過CTA和B超進(jìn)行模型驗(yàn)證。
　　5.組織工程骨體內(nèi)構(gòu)建6月后取材，采用灌注Microfil觀察、Micro-CT掃描并重建分析、以及組織學(xué)染色比較VB組和AV Loop組的組織工程骨血管化的差異。<

5、br>　　6.在不同時(shí)間點(diǎn)測量組織工程骨CT值;體內(nèi)構(gòu)建6月后取材，采用Micro-CT掃描分析，以及組織學(xué)染色比較VB組和AV Loop組的組織工程骨成骨效果的差異。
　　結(jié)果:
　　1.種子細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定:BMSCs能夠向骨、軟骨和脂肪方向分化;EPCs能夠攝取DiI-ac-LDL和結(jié)合FITC-UEA-1，在Matrigel上形成血管腔樣結(jié)構(gòu)并且VWF染色呈現(xiàn)陽性。
　　2.聯(lián)合EPCs裸鼠體內(nèi)構(gòu)建組織工

6、程骨:聯(lián)合EPCs組的骨密度和成骨面積均高于單獨(dú)BMSCs組(p＜0.05)。
　　3.聯(lián)合EPCs比格犬體內(nèi)構(gòu)建組織工程骨:Micro-CT和組織學(xué)分析顯示，聯(lián)合EPCs和單獨(dú)BMSCs的骨密度和成骨面積無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05);VWF免疫組織化學(xué)分析表明，聯(lián)合EPCs組的血管數(shù)量高于單獨(dú)BMSCs組(p＜0.05);CT值分析提示，聯(lián)合EPCs組相對(duì)CT值高于單獨(dú)BMSCs組(p＜0.05);組織學(xué)成骨面積分析提示，聯(lián)合E

7、PCs成骨面積大于單獨(dú)BMSCs組(p＜0.05)。
　　4.不同體內(nèi)預(yù)血管化方法的模型:CTA檢測提示AV Loop組的血管環(huán)在第2W、4W、8W通暢，B超證實(shí)血管環(huán)在6月仍通暢:VB組血管束不顯影。
　　5.不同體內(nèi)預(yù)血管化方法構(gòu)建組織工程骨的成血管比較:灌注Microfil并進(jìn)行Micro-CT掃描分析，結(jié)果表明VB組和AV Loop組生成的血管總體積和表面積無明顯差異(p＞0.05); VWF免疫組織化學(xué)分析顯示VB

8、組和AV Loop組的血管數(shù)量無明顯差異(p＞0.05)。
　　6.不同體內(nèi)預(yù)血管化方法構(gòu)建組織工程骨的成骨比較:CT、Micro-CT以及組織學(xué)分析顯示，VB組和AV Loop組的組織工程骨骨密度和成骨面積均無明顯差異(p＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.聯(lián)合EPCs作為種子細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)能夠促進(jìn)BMSCs的成骨;聯(lián)合EPCs作為種子細(xì)胞在比格犬體內(nèi)能夠促進(jìn)組織工程骨的成骨和血管生成。
　　2.采用比格犬下肢