組織工程肺血管化的初步研究.pdf

1、目的:慢性阻塞性肺疾病、肺間質(zhì)纖維化等慢性肺部疾病嚴(yán)重影響人類健康，而發(fā)展至終末期則治療方法非常有限。肺移植術(shù)受供體來源及需要術(shù)后免疫抑制的限制很難得到廣泛開展。應(yīng)用組織工程技術(shù)構(gòu)建組織工程肺替代移植肺組織成為治療的新選擇及研究方向。血液供應(yīng)、循環(huán)再建是組織工程肺能否在受體內(nèi)長(zhǎng)期存活的關(guān)鍵。本研究應(yīng)用大鼠肺來源間充質(zhì)干細(xì)胞(Lr-MSCs)、骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)以及肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(AT-Ⅱ)作為種子細(xì)胞，以Matrigel作為生

2、物支架，通過慢病毒載體轉(zhuǎn)染Lr-MSCs過表達(dá)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)，在大鼠體內(nèi)構(gòu)建組織工程肺，觀察新生血管的形成情況及其對(duì)組織工程肺體內(nèi)存活情況的影響。
　　方法:1.采用膠原酶消化法分離培養(yǎng)Lr-MSCs、密度梯度離心法分離培養(yǎng)EPCs、差速貼壁及免疫吸附法分離AT-Ⅱ，以三種細(xì)胞為種子細(xì)胞，以Matrigel為生物支架，于體外構(gòu)建組織工程肺泡樣結(jié)構(gòu)，通過HE染色、SP-A免疫組化以及透射電鏡對(duì)組織工程肺泡樣結(jié)構(gòu)進(jìn)

3、行分析評(píng)價(jià);2.以慢病毒為載體，將bFGF基因轉(zhuǎn)染至Lr-MSCs，ELISA法測(cè)定其過表達(dá)bFGF的情況，評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染bFGF基因的Lr-MSCs細(xì)胞上清液對(duì)EPCs遷移及成管能力的影響;3.將種子細(xì)胞分為三種組合:Lr-MSCs/EPCs/AT-Ⅱ（對(duì)照組，C組）、vector-Lr-MSCs/EPCs/AT-Ⅱ（病毒載體組，V組）、bFGF-Lr-MSCs/EPCs/AT-Ⅱ(bFGF轉(zhuǎn)染組，F(xiàn)組)，通過皮下注射的方式在大鼠體內(nèi)進(jìn)行組

4、織工程肺的構(gòu)建，應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)新生組織內(nèi)SP-A、CD31以及α-SMA的表達(dá)，并進(jìn)行定量分析，比較各組在2、3、4周時(shí)新生血管的形成及AT-Ⅱ細(xì)胞的存活情況。
　　結(jié)果:1.三種種子細(xì)胞與Matrigel進(jìn)行體外3D培養(yǎng)過程中可見圓形島狀生長(zhǎng)的AT-Ⅱ逐漸聚集呈細(xì)胞團(tuán)，細(xì)胞團(tuán)逐漸增大，約2周左右細(xì)胞團(tuán)中央細(xì)胞逐漸消散，形成“花環(huán)樣”結(jié)構(gòu);HE染色結(jié)果提示“花環(huán)樣”結(jié)構(gòu)與正常大鼠肺臟組織近似;免疫組織化學(xué)檢測(cè)，組成“花

5、環(huán)樣”結(jié)構(gòu)的細(xì)胞及細(xì)胞外均可見SP-A表達(dá);透射電鏡檢查可見組成“花環(huán)樣”結(jié)構(gòu)的細(xì)胞游離緣有微絨毛，胞核周圍有同心圓形的板層小體分布，證實(shí)AT-Ⅱ細(xì)胞存在，并保持外分化狀態(tài)。2.與Lr-MSCs及僅轉(zhuǎn)染病毒載體的Lr-MSCs比較，轉(zhuǎn)染bFGF基因的Lr-MSCs的細(xì)胞上清液中bFGF濃度明顯增高(p＜0.05);轉(zhuǎn)染bFGF基因的Lr-MSCs細(xì)胞上清液可明顯增加EPCs的遷移能力(p＜0.05)，縮短EPCs的成管時(shí)間(p＜0.05

6、)。3.與對(duì)照組、病毒載體組比較，bFGF轉(zhuǎn)染組構(gòu)建的組織工程肺在3周及4周時(shí)CD31及α-SMA表達(dá)量明顯增多(p＜0.05)，而2周時(shí)三組CD31及α-SMA表達(dá)量無明顯差別(p＞0.05);三組組織內(nèi)SP-A表達(dá)量隨時(shí)間逐漸減少，但三組之間各時(shí)間點(diǎn)SP-A的表達(dá)量無明顯差異(p＞0.05)。
　　結(jié)論:1.應(yīng)用Lr-MSCs、EPCs及AT-Ⅱ三種細(xì)胞作為種子細(xì)胞，Matrigel為生物支架，在體外及體內(nèi)均可成功構(gòu)建組織工程