Mfn2基因促進(jìn)血管平滑肌源性泡沫細(xì)胞膽固醇外排機(jī)制研究.pdf

1、第一部分外源性Mfn2基因表達(dá)抑制平滑肌源性泡沫細(xì)胞形成
　　1.目的：
　　研究平滑肌源性泡沫細(xì)胞內(nèi)外源性Mfn2基因表達(dá)水平對(duì)于泡沫細(xì)胞形成的影響,對(duì)細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出的影響,研究其可能存在的分子機(jī)制。
　　2.方法：
　　收集新鮮血清,采用密度梯度離心法提取LDL,銅離子氧化為ox-LDL后,與平滑肌細(xì)胞共培養(yǎng)24h或者48h,油紅O染色觀察泡沫細(xì)胞形成,體外構(gòu)建平滑肌源性泡沫細(xì)胞模型。采用不同滴度水平的Ad

2、v-Mfn2(20pfu/cell、40pfu/cell和60pfu/cell)干預(yù)平滑肌細(xì)胞模型24h后,觀察泡沫細(xì)胞形成的變化情況;酶化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)總膽固醇和游離膽固醇含量;采用Western Blot方法檢測(cè)膽固醇外轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCA1、ABCG1及核受體蛋白PPARγ蛋白磷酸化水平。
　　3.結(jié)果：
　　重組腺病毒Adv-Mfn2(60pfu/cell)轉(zhuǎn)染到平滑肌細(xì)胞內(nèi)作用24小時(shí)后,平滑肌源性泡沫細(xì)胞脂滴明顯減少

3、,酶化學(xué)法檢測(cè)證實(shí)細(xì)胞內(nèi)總膽固醇含量下降,膽固醇酯/總膽固醇比例明顯下降。Western Blot證實(shí)重組腺病毒Adv-Mfn2干預(yù)組PPARγ蛋白磷酸化水平下降,膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCA1、ABCG1表達(dá)水平上調(diào)。
　　4.結(jié)論：
　　細(xì)胞內(nèi)外源Mfn2基因在在適當(dāng)水平的表達(dá)可以干預(yù)泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇的蓄積從而可以降低泡沫細(xì)胞形成,這一機(jī)制是通過(guò)調(diào)節(jié)PPARγ磷酸化活性及其下游的膽固醇外轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCA1和ABCG1的表達(dá)來(lái)實(shí)

4、現(xiàn)。
　　第二部分外源性Mfn2基因?qū)ε菽?xì)胞形成絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路的影響
　　1.目的：
　　研究外源性Mfn2基因在平滑肌細(xì)胞內(nèi)不同表達(dá)水平對(duì)于平滑肌源性泡沫細(xì)胞內(nèi)與PPARγ活性相關(guān)的絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信號(hào)通路的影響,研究外源性Mfn2基因抑制平滑肌源性泡沫細(xì)胞形成的分子信號(hào)通路。
　　2.方法：
　　利用不同滴度水平重組腺病毒Adv-Mfn2(20pfu/cell、40pfu/

5、cell和60pfu/cell)轉(zhuǎn)染大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞24h,然后加入ox-LDL與平滑肌細(xì)胞共培養(yǎng)48小時(shí),采用Western Blot檢測(cè)ERK1/2、JNK、p38MAPKs信號(hào)通路蛋白磷酸化水平,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析上述蛋白磷酸化水平的差異。
　　3.結(jié)果：
　　Western Blot結(jié)果顯示重組腺病毒Adv-mfn2在60pfu/cell水平轉(zhuǎn)染大鼠平滑肌細(xì)胞條件下,ERK1/2、p38蛋白磷酸化水平明顯下調(diào),而與JNK