LncRNA H19-miR-675-5p通過(guò)靶向Mfn2調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡.pdf

1、目的：血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）是構(gòu)成血管壁組織結(jié)構(gòu)及維持血管張力的主要細(xì)胞成分，VSMC異常增殖和凋亡是動(dòng)脈粥樣硬化等血管重塑性疾病的病理學(xué)基礎(chǔ)。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸、沒(méi)有蛋白質(zhì)編碼功能的RNA，廣泛參與了VSMC的功能調(diào)控。我們通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，大量lncRNA在大鼠內(nèi)膜增生血管中表達(dá)出現(xiàn)異常

2、，其中l(wèi)ncRNA H19表達(dá)水平異常升高，H19是否參與了血管內(nèi)膜增生的調(diào)控？其分子機(jī)制如何？目前還不清楚。本研究擬從分子、細(xì)胞和整體水平，探究H19在VSMC增殖、凋亡和血管內(nèi)膜增生中的功能及分子機(jī)制。
　　方法：
　　1.對(duì)大鼠行頸總動(dòng)脈球囊內(nèi)皮剝脫術(shù)，構(gòu)建血管內(nèi)皮損傷模型，28天后將內(nèi)膜增生血管與正常血管取材，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。對(duì)差異mRNA進(jìn)行GO和Pathway分析，并通過(guò)qRT-PCR驗(yàn)證。
　　2.體

3、外培養(yǎng) VSMC并分別轉(zhuǎn)染 siRNA Control、siRNA H19、miR-675-5p inhibitor、siRNA H19＋miR-675-5p mimic、miR-675-5p mimic。使用CCK8檢測(cè)試劑盒對(duì)細(xì)胞活性進(jìn)行檢測(cè)，使用AnnexinV-FITC/PI染色檢測(cè)試劑盒配合流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期進(jìn)行檢測(cè)，使用Western Blot方法對(duì)相關(guān)基因的蛋白表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。
　　3.構(gòu)建pGL3-Mf

4、n2-3'UTR（包括野生型和突變型）報(bào)告基因重組載體，并進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)，用以確認(rèn)miR-675-5p與Mfn2的結(jié)合位點(diǎn)。
　　4.采用H19的siRNA干預(yù)大鼠頸總動(dòng)脈內(nèi)皮損傷模型，于21天后取血管樣本，通過(guò)冰凍切片HE染色分析血管內(nèi)膜／中膜比值，對(duì)內(nèi)膜增生情況進(jìn)行分析。
　　結(jié)果：
　　1.大鼠內(nèi)膜增生血管轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析
　　測(cè)序結(jié)果顯示，與正常血管相比，內(nèi)膜增生血管中有235個(gè)mRNA表達(dá)上調(diào)，17

5、0個(gè)mRNA表達(dá)下調(diào)；329個(gè)lncRNA表達(dá)上調(diào)，473個(gè)lncRNA表達(dá)下調(diào)。(Log2 fold change≥1.0或≤-1，P<0.05)。與正常血管相比，VSMC分化標(biāo)志基因鈣調(diào)蛋白（calponin，Cnn1）、平滑肌肌動(dòng)蛋白α2（smooth muscleα-actin，Acta2）、平滑肌22α（smooth muscle22 alpha，SM22α）、平滑肌肌球蛋白重鏈（smooth muscle myosin he

6、avy chain11，Myh11）、平滑肌細(xì)胞分化特異性蛋白（recombinant smoothelin, Smtn）等表達(dá)水平均明顯下降，表明大鼠血管內(nèi)膜損傷增生模型構(gòu)建成功。
　　對(duì)差異mRNA進(jìn)行GO和Pathway分析發(fā)現(xiàn)，與血管內(nèi)膜損傷增生相關(guān)的生物學(xué)進(jìn)程主要表現(xiàn)在骨骼肌收縮和肌絲滑動(dòng)等方面，而關(guān)聯(lián)性較大的通路也主要存在于心肌肥厚、心肌收縮、緊密連接等方面。以上參與的生物過(guò)程均與VSMC對(duì)血管生理功能的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，

7、可從多種途徑涉及VSMC的增殖與分化。
　　2.H19/miR-675-5p通過(guò)靶向Mfn2促進(jìn)VSMC增殖，并抑制其凋亡
　　進(jìn)一步比對(duì)探究，并通過(guò)qRT-PCR驗(yàn)證顯示，與正常血管相比，內(nèi)膜損傷后H19表達(dá)水平顯著升高。并且miR-675-5p作為H19基因第一外顯子區(qū)編碼生成的microRNA，其表達(dá)水平也顯著升高。初步證明H19/miR-675-5p可能在調(diào)控VSMC增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用。
　　將體外培養(yǎng)的

8、5組分別轉(zhuǎn)染siRNA Control、siRNA H19、miR-675-5p inhibitor、siRNA H19＋miR-675-5p mimic、miR-675-5p mimic的VSMC進(jìn)行多項(xiàng)檢測(cè)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，siRNA H19組和miR-675-5p inhibitor組細(xì)胞活性明顯降低，凋亡細(xì)胞比值升高而處于G2/M期的細(xì)胞比值降低，凋亡相關(guān)標(biāo)志蛋白表達(dá)量上升而增殖相關(guān)標(biāo)志蛋白表達(dá)量下降。miR-675-5

9、p mimic組細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果與siRNA H19組和miR-675-5p inhibitor組完全相反。共轉(zhuǎn)染siRNA H19和miR-675-5p mimic組的細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果則顯示加入miR-675-5p mimic可有效逆轉(zhuǎn)siRNA H19對(duì)細(xì)胞的影響（P<0.05）。證實(shí)H19/miR-675-5p參與VSMC細(xì)胞活性的調(diào)控，可促進(jìn)VSMC增殖，并抑制其凋亡。
　　通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析，Mfn2的3'UTR存在一個(gè)mi

10、R-675-5p結(jié)合位點(diǎn)，推測(cè)Mfn2可能是H19通過(guò)miR-675-5p發(fā)揮調(diào)控作用的下游靶點(diǎn)。熒光素酶報(bào)告基因分析結(jié)果表明，miR-675-5p與Mfn2的3'UTR存在直接相互作用。且Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，抑制miR-675-5p的表達(dá)后，與對(duì)照組相比Mfn2表達(dá)量有所上升（P<0.05），證實(shí)Mfn2可作為是miR-675-5p的調(diào)控靶標(biāo)。
　　3.敲降H19抑制大鼠血管內(nèi)膜增生
　　冰凍切片HE染色結(jié)果

11、顯示，球囊損傷后，內(nèi)膜呈彌漫性進(jìn)行性增厚，管腔變小，而敲降H19組內(nèi)膜增厚程度明顯小于對(duì)照組（P<0.05）。Western Blot分析進(jìn)一步表明，敲降 H19抑制了增殖表型標(biāo)志基因PCNA的表達(dá)，促進(jìn)了收縮表型標(biāo)志基因SM22α的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1.血管內(nèi)膜增生過(guò)程中，大量lncRNA表達(dá)水平發(fā)生改變；
　　2.Mfn2是miR-675-5p的調(diào)控靶標(biāo)；
　　3.lncRNA H19通過(guò)miR-675