銀杏葉提取物對(duì)酒精所致大鼠骨骼肌氧化凋亡損傷的保護(hù)及治療作用的研究.pdf

1、慢性酒精中毒性肌病(Chronic alcoholic myopathy，CAM)是由于長(zhǎng)期酗酒引起的一種肌肉病，在嗜酒者中發(fā)病率約40％—60％，臨床主要表現(xiàn)為肌無力、肌痛和肌萎縮，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。有資料表明長(zhǎng)期酗酒能夠引起骨骼肌氧化．抗氧化平衡失調(diào)以及骨骼肌細(xì)胞的過度凋亡。銀杏葉標(biāo)準(zhǔn)提取物(extract of Ginkgo biloba，EGb761)是從銀杏葉中提取的混合物(6％萜內(nèi)酯、24％黃酮苷)，研究表明其具有抗氧

2、化及抗凋亡作用。目前國(guó)內(nèi)外用銀杏葉提取物作為清除自由基和抗脂質(zhì)過氧化的藥物來治療心腦血管疾病等方面的報(bào)道很多，而在慢性酒精中毒性肌病中尚未見報(bào)道。在CAM患者日益增加的今天，對(duì)于該病發(fā)病機(jī)制及防治用藥的研究具有重要的社會(huì)意義。本實(shí)驗(yàn)擬討論酒精導(dǎo)致的氧化損傷對(duì)骨骼肌凋亡的影響及其相關(guān)機(jī)制，并以此為切入點(diǎn)研究銀杏葉提取物防治CAM的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 目的： 本實(shí)驗(yàn)從體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)兩個(gè)方面進(jìn)行研究。體

3、內(nèi)實(shí)驗(yàn)擬在建立大鼠慢性酒精中毒性肌病模型的基礎(chǔ)上，同時(shí)采用EGb761預(yù)防及治療，以Ⅱ型肌纖維為主的跖肌為研究對(duì)象觀察大鼠骨骼肌組織氧化-抗氧化指標(biāo)，骨骼肌細(xì)胞的凋亡率，凋亡相關(guān)基因的變化以及肌肉組織病理學(xué)的改變，探討EGb761的保護(hù)及治療作用及其可能的作用機(jī)制。體外實(shí)驗(yàn)擬在建立骨骼肌原代細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，給予無水乙醇及EGb761干預(yù)，觀察乙醇濃度及作用時(shí)間與骨骼肌細(xì)胞凋亡改變的關(guān)系，同時(shí)觀察EGb761對(duì)乙醇造成的骨骼肌細(xì)胞凋亡損

4、傷的保護(hù)作用。 方法： 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)： (1)選健康SPF級(jí)雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠70只隨機(jī)分成四組(對(duì)照組，酒精組，治療組，預(yù)防配合治療組)，在建立慢性酒精中毒性大鼠肌病模型的基礎(chǔ)上給予Egb761進(jìn)行預(yù)防(96μg/g bw per day)及治療(192μg/g bw per day)，四組均喂飼改良的全營(yíng)養(yǎng)高脂飼料，觀察實(shí)驗(yàn)前后各組大鼠體重、行為學(xué)變化及肌肉組織病理學(xué)改變。 (2

5、)于12周后，取后肢跖肌肌肉，制備成冰凍切片，經(jīng)組織化學(xué)染色確認(rèn)成模。 (3)采用AnnexinV/PI雙重染色法檢測(cè)各組大鼠跖肌的細(xì)胞凋亡率；采用免疫組織化學(xué)SABC法檢測(cè)凋亡蛋白Bax和Bcl-2的表達(dá)；采用RT-PCR的方法檢測(cè)各組大鼠跖肌中Bcl-2和Bax mRNA的表達(dá)：分光光度計(jì)法檢測(cè)各組跖肌丙二醛(MDA)含量，超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(iNOS)活性的變化。

6、 體外實(shí)驗(yàn)： (1)選健康SPF級(jí)雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠進(jìn)行骨骼肌原代細(xì)胞培養(yǎng)，并使用Desmin抗體采用免疫組化方法進(jìn)行骨骼肌細(xì)胞鑒定。 (2)以骨骼肌細(xì)胞作為研究對(duì)象，采用臺(tái)盼藍(lán)(Trypan blue)染色法檢測(cè)乙醇對(duì)骨骼肌細(xì)胞增殖的影響：Annexin V/PI雙重染色法及Hoechst33258熒光染色檢測(cè)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。(3)在乙醇作用的基礎(chǔ)上，采用噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)EGb761

7、對(duì)骨骼肌細(xì)胞增殖的影響，Annexin V/PI雙重染色法檢測(cè)EGb761對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。 結(jié)果： 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)： (1)實(shí)驗(yàn)前后大鼠體重變化顯示酒精組大鼠的體重隨著酒精的攝入逐漸下降，到12周時(shí)明顯低于對(duì)照組；EGb761干預(yù)后大鼠體重較酒精組有所升高。 (2)肌肉形態(tài)學(xué)觀察顯示酒精組大鼠骨骼肌纖維出現(xiàn)了肌纖維變性、壞死，肌纖維萎縮呈角形、條形或不規(guī)則形改變，肌間結(jié)締組織增生等病理改變。而與酒精組相比，E

8、Gb761明顯改善大鼠肌肉病變程度。 (3)Annexin V/PI雙重染色法結(jié)果顯示酒精組的細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組明顯升高，而EGb761干預(yù)后，細(xì)胞凋亡率較酒精組明顯下降。 (4)免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示酒精組與對(duì)照組相比Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)差異顯著，明顯增加，Bcl-2/Bax的比值下降；EGb761干預(yù)組與酒精組相比Bax蛋白表達(dá)顯著減少，Bel-2蛋白表達(dá)顯著增加，Bcl-2/Bax的比值亦升高。 (5)

9、RT-PCR結(jié)果顯示酒精組Bax和Bcl-2的mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組明顯增高；EGb761干預(yù)后，Bax表達(dá)較酒精組明顯下降，而Bcl-2明顯升高。 (6)生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果：酒精組MDA含量較對(duì)照組明顯升高，SOD、GSH-Px活性明顯下降，iNOS活性明顯升高；EGb761干預(yù)后，MDA含量較酒精組明顯下降，而SOD、GSH-Px活性明顯升高，iNOS活性明顯降低。 體外實(shí)驗(yàn)： (1)Desmin抗體免疫組化

10、結(jié)果顯示90％以上為骨骼肌細(xì)胞。 (2)臺(tái)盼藍(lán)(Trypan blue)染色法結(jié)果顯示細(xì)胞生存率隨著乙醇濃度的增加逐漸降低，而細(xì)胞死亡率隨著乙醇作用時(shí)間的增加而逐漸升高。 (3)Annexin V/PI雙重染色法及Hoechst33258熒光染色結(jié)果顯示，乙醇作用后骨骼肌細(xì)胞凋亡率呈時(shí)間及劑量相關(guān)性增加。 (4)MTT法結(jié)果顯示EGb761作用后，乙醇作用后的骨骼肌細(xì)胞生存率隨著EGb761濃度的增加而升高。An

11、nexin V/PI雙重染色法結(jié)果顯示EGb761可降低乙醇誘導(dǎo)的骨骼肌細(xì)胞凋亡。 結(jié)論： (1)長(zhǎng)期酒精攝入可造成骨骼肌細(xì)胞凋亡，推測(cè)與氧化．抗氧化失衡，iNOS增多及改變凋亡相關(guān)基因Bax和Bc1-2的表達(dá)有關(guān)。 (2)EGb761可降低CAM骨骼肌細(xì)胞凋亡率，推測(cè)與抑制氧自由基的生成，降低iNOS活性，下調(diào)促凋亡基因Bax，上調(diào)抑凋亡基因Bc1-2的表達(dá)有關(guān)。 (3)EGb761對(duì)慢性酒精中毒性肌病