SPOP通過調(diào)控Hh-Gli信號通路影響胃癌細胞生物學(xué)行為的研究.pdf

1、第一部分: SPOP在人胃癌組織中的表達及其與臨床病理特征的關(guān)系
　　目的:探討SPOP在人胃癌細胞系、人胃癌組織中的表達及臨床意義。
　　方法:免疫組織化學(xué)方法檢測101例胃癌組織及相應(yīng)癌旁組織的SPOP的表達,統(tǒng)計分析其與臨床病理特征的關(guān)系;Western blot方法檢測4例胃癌組織及癌旁組織的SPOP的表達;Western blot方法檢測4株胃癌及1株永生化正常胃黏膜上皮細胞株細胞中的SPOP的表達。
　　結(jié)

2、果:1、101例胃癌組織中,88例癌組織中的SPOP的表達低于相應(yīng)的癌旁組織,兩者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。SPOP在癌組織中的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移成正相關(guān)(r=0.225,P<0.05),與腫瘤分化程度(r=-0.232,P<0.05)及TNM分期(r=-0.375,P<0.01)成負相關(guān),但與患者的年齡、性別均不相關(guān);2、Western blot檢測4例癌組織中SPOP表達均低于相應(yīng)的癌旁組織;3、在人永生化胃粘膜上皮細胞系G

3、ES-1及四株胃癌細胞株AGS,SGC-7901,MKN-28,MKN-45中均有表達。
　　結(jié)論:1、SPOP在胃癌組織中表達下調(diào),與癌旁組織中的表達比較存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);2、SPOP表達與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度及TNM分期相關(guān),但與患者性別、年齡均不相關(guān)。
　　第二部分:SPOP基因表達質(zhì)粒和SPOP-shRNA質(zhì)粒構(gòu)建及胃癌細胞模型的篩選與鑒定
　　目的:為了進一步研究SPOP在胃癌中的作用

4、機制,我們構(gòu)建SPOP基因表達質(zhì)粒SPOP-V5/His和干擾質(zhì)粒SPOP-shRNA質(zhì)粒,并構(gòu)建SPOP高/低表達胃癌細胞模型。
　　方法:1、通過基因克隆技術(shù)獲得人SPOP基因cDNA序列,將其克隆,酶切,連接載體pUB6/V5-HisB,構(gòu)建SPOP基因表達質(zhì)粒SPOP-V5/His,并構(gòu)建表達SPOP的胃癌穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系,利用免疫印跡法鑒定表達產(chǎn)物;2、針對人SPOP基因的pcDNATM6.2-GW/EmGFP載體構(gòu)建SPOP

5、-shRNA質(zhì)粒,免疫印跡法鑒定表達產(chǎn)物,用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染MKN45細胞并流式細胞儀分選,構(gòu)建低表達SPOP的胃癌細胞模型,利用免疫印跡法鑒定表達產(chǎn)物。
　　結(jié)果:1、成功構(gòu)建SPOP-V5/His表達質(zhì)粒;2、以AGS為基礎(chǔ)成功構(gòu)建了穩(wěn)轉(zhuǎn)表達SPOP的胃癌細胞系模型;3、成功構(gòu)建SPOP干擾質(zhì)粒SPOP-shRNA,經(jīng)Western blot鑒定顯示 SPOP-shRNA-1430的干擾效果最好;4、將SPOP-shRNA-

6、1430轉(zhuǎn)染到MKN-45胃癌細胞中,流式細胞儀分選,成功構(gòu)建了低表達SPOP的胃癌細胞模型。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建SPOP-V5/His表達質(zhì)粒和SPOP-shRNA質(zhì)粒,并構(gòu)建SPOP基因過表達和低表達的胃癌細胞模型。
　　第三部分: SPOP對胃癌細胞生物學(xué)行為的影響
　　目的:研究SPOP對胃癌細胞生物學(xué)行為的影響。
　　方法:利用本研究第二部分建立的SPOP表達質(zhì)粒SPOP-V5/His構(gòu)建過表達SPOP

7、的胃癌細胞模型;利用SPOP干擾質(zhì)粒SPOP-shRNA,構(gòu)建低表達SPOP的胃癌細胞模型,采用MTT法檢測、劃痕實驗、平板克隆形成實驗,體外觀察SPOP表達改變后,對胃癌細胞增殖、遷移、克隆形成等生物學(xué)行為的影響。
　　結(jié)果:MTT法檢測證實過表達SPOP抑制胃癌細胞AGS增殖能力,抑制SPOP表達后促進胃癌細胞MKN-45的增殖;劃痕實驗證實過表達SPOP能夠降低AGS細胞的遷移能力,抑制SPOP表達后能夠增強MKN-45細胞

8、的遷移能力;克隆形成實驗顯示過表達SPOP抑制AGS細胞克隆形成,抑制SPOP表達后促進MKN-45細胞克隆形成。
　　結(jié)論:SPOP具有抑制胃癌細胞增殖、遷移及克隆形成的作用,有可能成為胃癌治療的新型候選靶點或診斷指標。
　　第四部分: SPOP通過Hh/Gli信號通路影響胃癌細胞生物學(xué)行為的機制研究
　　目的:研究SPOP對Hh/Gli信號通路的調(diào)控作用。
　　方法:免疫共沉淀、免疫細胞化學(xué)實驗檢測SPOP與

9、Gli2存在相互作用;建立SPOP表達質(zhì)粒Myc-SPOP轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞株,檢測其對Gli2的影響及對下游靶基因的影響; Dual Luciferase reporter試驗檢測SPOP對Hh/Gli信號通路的影響。
　　結(jié)果:免疫共沉淀實驗檢測證實SPOP與Gli2存在相互作用;免疫細胞化學(xué)實驗中激光共聚焦觀察到Gli2表達與胞漿中SPOP表達呈負相關(guān)關(guān)系;增加SPOP的表達可降低Gli2的蛋白水平,但不影響其mRNA