核酸探針與核酸酶結(jié)合在分析檢測中的應(yīng)用.pdf

1、核酸探針易于合成、穩(wěn)定性好、設(shè)計簡單、信號機制靈活,已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和化學(xué)等領(lǐng)域。核酸探針與核酸酶結(jié)合可以形成多種靈活的分子識別信號轉(zhuǎn)換機制,不僅可以實現(xiàn)高靈敏、高特異性檢測,還用于生物分子相互作用的實時、動態(tài)監(jiān)測?；诖?本文把核酸探針與核酸酶相結(jié)合應(yīng)用于分析檢測中,利用核酸探針靈活的信號機制和核酸酶的特異性,具體開展了以下3個方面的工作:
　　 1.基于雙鏈探針和核酸外切酶Ⅰ,發(fā)展了一種放大檢測小分子的新方法。核酸外

2、切酶Ⅰ只特異性從3’→5’切割DNA單鏈。首先構(gòu)建抗核酸外切酶Ⅰ的核酸適體-cDNA雙鏈探針,當(dāng)有腺苷存在時,通過競爭反應(yīng),腺苷與核酸適體結(jié)合,雙鏈熒光探針被打開,核酸外切酶Ⅰ可以水解核酸適體和互補DNA暴露的3’-OH端,釋放出來的腺苷繼續(xù)結(jié)合另一條核酸適體探針,如此循環(huán),熒光信號不斷增強。通過檢測酶切反應(yīng)初速度,實現(xiàn)了小分子腺苷簡單、快速的檢測。該方法利用沒有序列特異性的核酸外切酶Ⅰ進行放大,序列設(shè)計簡單,對腺苷的檢測具有良好的特異

3、性和靈敏度,檢測下限為0.65μM,比傳統(tǒng)核酸適體雙鏈探針方法的檢測下限(26μM)降低了兩個數(shù)量級,有望發(fā)展為一種設(shè)計簡單、通用的小分子放大檢測的方法。
　　 2.基于帶AP位點的分子信標(biāo),發(fā)展了一種APE1酶活性分析的新方法。APE1可以切割帶AP位點的DNA。設(shè)計了兩條分子信標(biāo),一條為臂部雙鏈區(qū)帶有一個AP位點的長臂分子信標(biāo)(P1),另一條為環(huán)部單鏈區(qū)帶有一個AP位點的常規(guī)分子信標(biāo)(P2)。把它們作為APE1酶底物,比較了

4、二者的性能。通過檢測酶切初速度,用性能更好的P1探針對APE1酶活性進行了分析。該方法結(jié)合了APE1的特性和分子信標(biāo)靈活的信號機制,設(shè)計簡單,APE1酶的檢測下限為0.25 U/mL,線性范圍為0.25-50 U/mL,是一種簡單的APE1酶活性的分析方法。
　　 3.基于分子信標(biāo)和S1核酸酶發(fā)展了一種檢測鋅離子的新方法。S1核酸酶是一種單鏈核酸內(nèi)切酶,其酶切速度對鋅離子有很強的依賴性。使用分子信標(biāo)作為S1核酸酶的底物,通過檢測