青藤堿聯(lián)合甲氨蝶呤抵制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎骨破壞的作用及機制研究.pdf

1、目的：
　　 探討青藤堿(Sinomenine，SIN)聯(lián)合甲氨蝶呤(Methotrexate，MTX)抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎骨破壞的作用及機制。
　　 方法：
　　 實驗一：
　　 建立Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)的SD大鼠關(guān)節(jié)炎模型，隨機分為模型組（生理鹽水灌胃）、青藤堿組（正清風(fēng)痛寧120mg/kg.d，灌胃）、MTX組(1mg/kg.w，腹腔注射)、聯(lián)合組(正清風(fēng)痛寧+MTX組，正清風(fēng)痛寧120mg/kg.d和MT

2、X1mg/kg.w)，另設(shè)7只作為正常對照組。首次免疫注射第21天開始給藥。采用關(guān)節(jié)評分法評估關(guān)節(jié)炎癥程度；并用ELISA法分析大鼠血清中OPG、RANKL、IL-17、IL-1α、IL-6、MMP-1、MMP-3、MMP-13的表達(dá)水平；大鼠關(guān)節(jié)HE染色的組織病理變化及免疫組化比較RANKL、OPN表達(dá)的變化。
　　 實驗二：
　　 從RA患者滑膜組織分離培養(yǎng)FLS，用不同質(zhì)量濃度的SIN(1，0.1，0.01，0.0

3、001mg/ml)與MTX(1，0.1，0.01，0.001mg/ml)單獨或聯(lián)合干預(yù)。用四甲基偶氮唑藍(lán)法(MTT)檢測細(xì)胞增殖情況；用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況；用半定量RT-PCR的方法檢測FLS中NF-KB受體活化因子配體(RANKL)、骨保護(hù)素(OPG)的mRNA表達(dá)水平。
　　 實驗三：
　　 從健康人外周血中分離PBMC，用不同質(zhì)量濃度的SIN(1000，100，1OuM)與MTX(1OuM)單獨或聯(lián)合干預(yù)，

4、用四甲基偶氮唑藍(lán)法(MTT)檢測細(xì)胞增殖情況；用RANKL（60ng/ml）、M-CSF（20ng/ml）誘導(dǎo)PBMC分化成破骨細(xì)胞(OC)，加入不同質(zhì)量濃度的SIN與MTX單獨或聯(lián)合干預(yù)，第15d終止培養(yǎng)，ELISA法測定各加藥組細(xì)胞上清液中分泌的MMP-9水平；同時細(xì)胞固定行TRAP染色，觀察藥物干預(yù)對于OC分化的影響；用定量RT-PCR的方法檢測PBMC中破骨細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄因子NFATclmRNA的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：<

5、br>　　 實驗一：
　　 1．造模后，大鼠關(guān)節(jié)炎腫脹程度在第21d最為明顯，然后逐漸消退，在第35d左右會出現(xiàn)第2個炎癥高峰。SIN組、MTX組和聯(lián)合組均可減輕關(guān)節(jié)腫脹，與造模組比較，關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分在第46d均有明顯下降（P＜0.05）。
　　 2．與模型組比較，MTX組、聯(lián)合組可明顯抑制大鼠血清IL-1α的表達(dá)水平(P＜0.05），IL-6表達(dá)水平也有下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05）；與MTX組比較，聯(lián)合組

6、IL-1α、IL-17水平顯著降低(P＜0.05）。
　　 3．與模型組比較，SIN組、聯(lián)合組都可明顯抑制血清MMP-3和MMP-13的產(chǎn)生，MTX組MMP-13水平降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與MTX組相比，聯(lián)合組血清MMP-3的表達(dá)水平下降（P＜0.05）。
　　 4．與模型組比較，SIN組、MTX組和聯(lián)合組外周血OPG水平均明顯升高，MTX組可降低血清RANKL的表達(dá)水平，三組OPG/RANKL的比值

7、顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)：與MTX組相比，聯(lián)合組OPG/RANKL比值升高(P＜0.05)。
　　 5．與正常組比較，模型組炎性組織侵潤關(guān)節(jié)腔隙，使得腔隙變窄。SIN組、MTX組和聯(lián)合組均能改善炎性細(xì)胞的侵潤，聯(lián)合組能更有效抑制CIA大鼠滑膜關(guān)節(jié)炎癥與組織破壞。
　　 6.與正常組比較，模型組滑膜組織OPN、RANKL蛋白表達(dá)顯著增高（P＜0.05）；與模型組比較，聯(lián)合組、MTX組、SIN組均能降低O

8、PN、RANKL蛋白的表達(dá)(P＜0.05）；與MTX組相比，聯(lián)合組OPN、RANKL蛋白的表達(dá)明顯下降(P＜0.05)。
　　 實驗二：
　　 1.各不同質(zhì)量濃度藥物組對RAFLS的增殖均有顯著的抑制作用(P＜0.05)；但在0.001mg/ml至1mg/ml的濃度范圍內(nèi)，同種藥物干預(yù)組（SIN單用、MTX單用、SIN與MTX聯(lián)合）的抑制作用與藥物濃度并無明顯正相關(guān)性；SIN0.1mg/ml+MTX0.1mg/ml組較其

9、他非聯(lián)合用藥組對RAFLS的抑制作用顯著增強(P＜0.05)。
　　 2．流式細(xì)胞儀檢測各組凋亡細(xì)胞百分率結(jié)果顯示：空白對照組25.3％，MTX組(MTXO.1mg/ml)28.4%，SIN組(SIN0.1mg/ml)32.3%，聯(lián)合組（MTX0.1mg/ml+SIN0.1mg/ml）34.7%。各加藥組凋亡細(xì)胞百分率均高于空白對照組，但SIN組和聯(lián)合組明顯誘導(dǎo)RAFLS凋亡(P＜0.05)；與MTX組比較，聯(lián)合組凋亡細(xì)胞百分率

10、有明顯增多(P＜0.05)。
　　 3.RT-PCR結(jié)果顯示：與空白組比較，MTX組（MTX0.1mg/ml）、SIN組(SIN0.1mg/ml)、聯(lián)合組(MTX0.1mg/ml+SIN0.1mg/ml)RANKL電泳條帶均弱；聯(lián)合組OPG電泳條帶較空白組強。聯(lián)合組能夠有效下調(diào)RAFLS的RANKLmRNA表達(dá)，并上調(diào)其OPGmRNA表達(dá)(P＜0.05)。
　　 實驗三：
　　 1．加藥組對PBMC增殖的影響，M

11、TT結(jié)果顯示各濃度組藥物（包括聯(lián)合給藥），在不同藥物組處理細(xì)胞48h后，并未影響細(xì)胞的增殖(P＞0.05)。
　　 2．加藥組對OC的分化均有不同程度的抑制作用，ELISA結(jié)果顯示，高濃度SIN與MTX(SIN1OOOuM+MTX10uM)合用時，能夠明顯抑制MMP-9的分泌，其他給藥組分泌的MMP-9未顯示出差異；該濃度的藥物處理誘導(dǎo)分化的PBMC，TRAP染色后顯微鏡下觀察分化成熟的OC數(shù)目，結(jié)果顯示聯(lián)合組(SIN1000u

12、M+MTX10uM)與對照組和單獨用藥組比較OC數(shù)目顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.RT-PCR結(jié)果顯示：與對照組及MTX組比較，給藥24h后，SIN聯(lián)合MTX(SIN1OOOuM+MTX10uM)能夠有效下調(diào)PBMC中的NFATc1mRNA表達(dá)(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 實驗一：
　　 SIN與MTX聯(lián)合給藥對CIA大鼠關(guān)節(jié)腫脹有明顯的防治效應(yīng)，能夠較好地控制炎癥發(fā)生

13、發(fā)展，可能與其對血清IL-1、IL-6、IL-17等抑制作用有關(guān)；協(xié)同提高外周血OPG、OPG/RANKL比值、抑制MMP-3和MMP-13的產(chǎn)生；抑制關(guān)節(jié)血管翳的形成和炎性因子的侵潤，下調(diào)滑膜組織RANKL及OPN的表達(dá)水平。提示SIN聯(lián)合MTX對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的軟骨和骨有協(xié)同骨保護(hù)作用。
　　 實驗二：
　　 本實驗表明SIN與MTX聯(lián)用對RAFLS具有協(xié)同抑制效應(yīng)，并可能由此實現(xiàn)對RAFLS介導(dǎo)的骨破壞的治療作用。<