葛根素通過ERK信號(hào)通路促進(jìn)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞成骨分化.pdf

1、目的:在體外擴(kuò)增培養(yǎng)的過程中，探討不同濃度的葛根素對人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cell)生物學(xué)特征的改變及成骨分化調(diào)控作用機(jī)制，從而為將來間質(zhì)干細(xì)胞和葛根素臨床應(yīng)用提供一些理論依據(jù)。
　　方法:(1)分離培養(yǎng)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞，采用全骨髓直接貼壁法。借助于形態(tài)特征、表面抗原標(biāo)記等對其進(jìn)行生物學(xué)特性鑒定。(2)運(yùn)用MTT法檢測葛根素對骨髓間質(zhì)干細(xì)胞增殖能力和生長曲線的影響。采用衰老相關(guān)β

2、-半乳糖苷酶染色(SA-β-gal)，檢測不同濃度葛根素對骨髓間質(zhì)干細(xì)胞衰老的影響，堿性磷酸酶染色檢測不同濃度葛根素對骨髓間質(zhì)干細(xì)胞成骨分化，油紅O細(xì)胞化學(xué)染色檢測其成脂分化能力，流式細(xì)胞儀分析檢測其細(xì)胞凋亡情況，采用transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測不同濃度葛根素對骨髓間質(zhì)干細(xì)胞遷移能力的差異，RT-PCR技術(shù)檢測ALP基因水平表達(dá)的差異，采用Western blot檢測不同濃度葛根素對骨髓間質(zhì)干細(xì)胞ERK蛋白表達(dá)的影響(3)采用Grap

3、hPad Prism5.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，當(dāng)p＜0.05時(shí)，認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:(1)從骨髓組織中分離出一種長梭形細(xì)胞，經(jīng)純化后流式細(xì)胞儀鑒定符合間質(zhì)干細(xì)胞相應(yīng)表面標(biāo)志:CD29(+)，CD44(+)，CD90(+)，CD105(+)，CD34(-)及HLA-DR(-)。(2)不同濃度葛根素對骨髓間質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)的改變，DAPI染核顯示，在對照組細(xì)胞核中DNA呈均一分布，而實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞核則呈現(xiàn)比較明顯的DNA點(diǎn)塊狀

4、聚集。(3)MTT檢測結(jié)果顯示，增殖能力隨著葛根素濃度增加而下降。流式細(xì)胞凋亡顯示，隨著葛根素濃度增加，凋亡細(xì)胞的數(shù)量也在增加，此外，transwell遷移實(shí)驗(yàn)顯示，隨著葛根素濃度增加，細(xì)胞的遷移能力下降。(4)分化能力:成骨誘導(dǎo)14天，堿性磷酸酶染色顯示，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞誘導(dǎo)分化能力均隨葛根素濃度的增加而增加。(5)基因表達(dá):RT-PCR顯示，與對照組細(xì)胞相比，實(shí)驗(yàn)組ALP mRNA表達(dá)量表達(dá)上調(diào)。(6)western blo