同種異體臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞組織工程骨構(gòu)建人工椎板的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:①膠原酶消化法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法分離、純化、培養(yǎng)兔臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（Rabbit umbilical cord mesenchymal stem cells，rUCMSCs），為組織工程骨的構(gòu)建提供種子細(xì)胞。②鑒定所獲種子細(xì)胞為rUCMSCs。③評(píng)價(jià)納米羥基磷灰石-殼聚糖（nano-hydroxyapatite-chitosan，nHA-CS）支架和殼聚糖(chitosan，CS)支架與rUCMSCs的生物相容性，并通過PCR(Pol

2、ymemse chain reaction)法評(píng)價(jià)rUCMSCs成骨誘導(dǎo)后的成骨潛能變化。④評(píng)價(jià)rUCMSCs-nHA-CS支架復(fù)合體(簡稱rUCMSCs-nHA-CS)和rUCMSCs-CS支架復(fù)合體（簡稱rUCMSCs-CS）構(gòu)建人工椎板的可行性。
　　方法:①無菌條件下收集孕約21天孕兔臍帶，剪成大約1mm3大小組織塊后，采用膠原酶消化法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法獲得形態(tài)較為單一的貼壁細(xì)胞。②通過形態(tài)學(xué)觀察法、細(xì)胞表面標(biāo)志物流式細(xì)胞術(shù)(

3、Flow Cytometry，F(xiàn)CM)和PCR檢測(cè)法、三系分化誘導(dǎo)后細(xì)胞染色和PCR檢測(cè)法對(duì)所獲細(xì)胞進(jìn)行鑒定。③將P3代rUCMSCs種植在nHA-CS、CS支架上，比較24h細(xì)胞粘附率，并設(shè)置單純細(xì)胞對(duì)照組，細(xì)胞粘附率=（接種細(xì)胞數(shù)一未粘附細(xì)胞數(shù)）/接種細(xì)胞數(shù);倒置顯微鏡觀察細(xì)胞在兩種支架周圍的生長狀態(tài);采用CCK-8(Cell counting kit-8)法測(cè)定nHA-CS組、CS組以及單純細(xì)胞組的rUCMSCs生長曲線;PI染色

4、和掃描電鏡觀察細(xì)胞在支架上的粘附狀況。將rUCMSCs成骨誘導(dǎo)4周，用熒光定量PCR法(Quantitative polymerase chain reaction，qPCR)檢測(cè)每周細(xì)胞中Runx2表達(dá)變化。④將體重為2.0kg-2.3kg，平均（2.13±0.11）kg，共150只健康雄性新西蘭大耳白兔隨機(jī)分為五組:Ⅰ組為rUCMSCs-nHA-CS組，Ⅱ組為rUCMSCs-CS組，Ⅲ組為nHA-CS組，Ⅳ組為CS組，Ⅴ組為空白對(duì)照

5、組，制備L5椎板缺損實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，缺損長寬約為10mm×8mm大小，將相應(yīng)材料置入缺損椎板處，分別于術(shù)后2、4、8、12、16周對(duì)各組行CT、MRI掃描，并處死動(dòng)物后解剖出相應(yīng)椎體行microCT掃描、蘇木精伊紅染色(Hematoxylin eosin staining，HE staining)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（Bone morphogenetic protein2，BMP-2）染色、骨鈣素(Osteocalcin，OCN)等組織學(xué)檢

6、測(cè)，以多種方法評(píng)估各組的成骨情況和椎板重建情況。
　　結(jié)果:①采用膠原酶消化法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法獲得人量形態(tài)較為均一，呈梭形和成纖維狀，具備方向性排列的貼壁細(xì)胞。②流式細(xì)胞術(shù)和PCR法檢測(cè)純化后的貼壁細(xì)胞均表達(dá)CD105、CD73和CD90，不表達(dá)CD45、CD34，細(xì)胞經(jīng)三向誘導(dǎo)分化后茜素紅染色、油紅O染色陽性，Runx2、PPARγ和Sox9基因表達(dá)增高，表明細(xì)胞能分化為成骨、成脂和成軟骨細(xì)胞，鑒定所獲細(xì)胞為rUCMSCs。③nH

7、A-CS組、CS組以及單純細(xì)胞組，接種24后的細(xì)胞平均粘附率分別為:(89.48±1.54)％、(88.58±2.12)％、(89.52±1.01)％，統(tǒng)計(jì)分析顯示在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞粘附率無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。細(xì)胞支架復(fù)合培養(yǎng)24h后，CS支架和nHA-CS支架周圍均可見細(xì)胞圍繞支架邊緣貼壁生長，細(xì)胞呈梭形，鏡下透亮度高，細(xì)胞狀態(tài)良好。rUCMSCs-nHA-CS組、rUCMSCs-CS組以及rUCMSCs組細(xì)胞接種后1-2天為增殖緩慢，第3

8、-5天細(xì)胞增殖速度明顯升高，至6-8天三組細(xì)胞增殖速度減緩。三組曲線整體趨勢(shì)相同，略顯“S”形，無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。PI染色和電鏡掃描示細(xì)胞接種48h后大量細(xì)胞粘附于nHA-CS支架和CS支架孔壁之上。成骨誘導(dǎo)第1周Runx表達(dá)明顯增高，并一直維持至誘導(dǎo)第4周，表明rUCMSCs具有較快的成骨能力，且成骨能力較強(qiáng)。④各組無硬脊膜壓迫，手術(shù)及相鄰節(jié)段椎體無滑脫、脊柱側(cè)彎、椎間盤突出等病變。rUCMSCs-nHA-CS組、nHA-CS組、rU

9、CMSCs-CS組骨組織影子術(shù)后第2周即可見，而CS組則在第4周以后才形成骨組織影，隨著時(shí)間增長，各組骨組織影密度逐漸增加，即骨小梁數(shù)量和厚度逐漸增多，間隔逐漸變小，16周后各組（除空白對(duì)照組外）均形成了質(zhì)量不一、完整且光滑的椎板，形成的椎板弧度與硬脊膜背面相一致，但細(xì)胞支架組重建能力優(yōu)于單純支架組，含HA組優(yōu)于不含HA組。術(shù)后2周HE染色示，rUCMSCs-nHA-CS組支架孔隙內(nèi)骨樣組織沉積多于rUCMSCs-CS組，至術(shù)后16周r

10、UCMSCs-nHA-CS組和rUCMSCs-CS組均形成大量編織狀骨。免疫組化示rUCMSCs-nHA-CS組術(shù)后16周時(shí)BMP-2、OCN陽性表達(dá)。
　　結(jié)論:①膠原酶消化法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法是一種理想的分離rUCMSCs的方法。②從形態(tài)學(xué)、細(xì)胞表面標(biāo)志物、多向分化潛能等方面鑒定所獲得的細(xì)胞為rUCMSCs。③nHA-CS支架和CS支架與rUCMSCs之間均有良好的體外生物相容性，且兩種支架在細(xì)胞相容性方面無明顯差異。rUCMSC