重組人骨形成蛋白成熟肽-4對輻射小鼠骨髓造血損傷修復(fù)作用初探.pdf

1、骨形成蛋白(BoneMorphogeneticProteins，BMPs)是一種分泌型糖蛋白，具有多種生物學功能。BMP2和BMP4是骨形成蛋白家族中的兩個重要成員，在結(jié)構(gòu)和功能上這兩種蛋白都非常相似，兩者都能夠誘導(dǎo)骨組織的生成和造血組織的分化等，但BMP2誘導(dǎo)骨組織形成的活性更強，BMP4則對造血組織的作用更突出。在成體，BMP2誘導(dǎo)異位骨形成，成為用于骨組織工程的重要誘導(dǎo)因子；BMP4則可以促進造血干細胞的增殖，并誘導(dǎo)造血干細胞向紅

2、系、粒系和巨噬細胞系三系細胞分化，從而能夠促進受損傷的造血系統(tǒng)的全面再生與恢復(fù)；這些特性使得BMP2和BMP4都具有很好的臨床應(yīng)用前景。 在BMP的制備過程中，真核表達系統(tǒng)表達量低，表達產(chǎn)物回收、純化困難、生產(chǎn)成本很高；原核表達系統(tǒng)，特別是大腸桿菌系統(tǒng)，具有表達效率高，容易操作，容易監(jiān)控，產(chǎn)物穩(wěn)定，生產(chǎn)成本低等優(yōu)點，故而我們在進行BMP的大規(guī)模制備過程中選擇了大腸桿菌表達系統(tǒng)。目前，重組人骨形成蛋白2的大規(guī)模制備已有較多報道，本

3、研究的目的，就是應(yīng)用我們目前已經(jīng)比較成熟的制備BMP2的工藝，來制備BMP4，來驗證大規(guī)模制備這兩種蛋白時，能否用相同的發(fā)酵程序及相近的純化方法。 兩種工程菌株(DH5α/pDH2-BMP-4m及DH5α/pDH2-BMP-2m)分別含有能夠高表達人骨形成蛋白成熟肽(Bonemorphogeneticproteinmaturepeptide，hBMP-m)hBMP-4m和hBMP-2m的質(zhì)粒，分別導(dǎo)入15升NBS發(fā)酵罐中進行恒溶

4、氧高密度發(fā)酵和誘導(dǎo)表達，測定發(fā)酵菌液OD600值分別為30.8和32.3。離心收集菌體，PAGE電泳后光密度掃描表明hBMP-4m占細菌總蛋白量的42％，hBMP-2m占細菌總蛋白量的47.2％。懸浮所收集的菌體，裂菌，洗滌4次后的包涵體中hBMP-4m占蛋白量的82.9％，hBMP-2m占蛋白量的84.5％。預(yù)先取少量樣品進行探索實驗后，全部包涵體分別用8M尿素緩沖液溶解，上SepharoseSP-FF陽離子柱，分別收集0.35MNa

5、Cl和0.2MNaCl洗脫部分，獲得純度為96％的hBMP-4m及純度為95％的hBMP-2m。其收獲量分別為1.3g/L發(fā)酵液和1.25g/L發(fā)酵液；收得率分別為34.33％和34.81％。結(jié)果表明大規(guī)模制備hBMP-4m,及hBMP-2m時，可以使用相同的發(fā)酵程序及相近的純化方法，都能夠得到較好的收得率、較高的收獲量和純度。 將經(jīng)過上述大規(guī)模制備的rhBMP-4m和rhBMP-2m在不使用任何吸附載體的情況下、分別直接植入小

6、鼠肌肉中，結(jié)果都在局部生成骨組織，這整體動物試驗證實兩者都是具備成骨活性的，這更進一步證明了我們的制備及純化方法是行之有效的。在動物試驗過程中，rhBMP-4m和rhBMP-2m表現(xiàn)出了不同程度的誘導(dǎo)骨形成的能力，其中，rhBMP-2m的誘骨能力最強，第2周就有骨小梁形成；而rhBMP-4m的成骨能力較弱，至第4周方始形成軟骨。 BMP4已被證實是一種造血調(diào)控因子，有研究指出，其在低濃度時可促進造血干細胞的增殖和分化，高濃度時則

7、可促進造血干細胞再生能力的提高，從而促骨髓增殖能力更持久，說明BMP4對造血干細胞的存活有直接影響。 骨髓造血細胞對射線敏感，輻射能夠直接致死骨髓造血細胞或誘導(dǎo)骨髓造血細胞發(fā)生凋亡，引起造血干細胞數(shù)量下降。CD34抗原是是一種階段特異性白細胞分化抗原，選擇性表達于人類造血干細胞、祖細胞和血管內(nèi)皮細胞表面。CD34+細胞則是非均質(zhì)的細胞群，其中既含有造血干細胞也存在不同分化階段的造血祖細胞。因此，CD34表面抗原的檢測是能夠反映骨

8、髓造血的狀況的指標之一，對造血干細胞的確認、計數(shù)、分離和控制具有重要價值。已有實驗證實BMP2能夠提高輻射小鼠的存活率，并對輻射小鼠骨髓造血功能的恢復(fù)具有促進作用；但是BMP4對輻射小鼠是否具有類似作用，目前尚無報道，本實驗觀察重組人骨形成蛋白成熟肽-4對輻射小鼠骨髓造血功能的促進作用，為骨形成蛋白治療輻射引起的骨髓造血損傷提供一定的依據(jù)。 1.建立小鼠骨髓型急性放射損傷的動物模型，分離和純化骨髓單個核細胞，確定本課題研究的基本

9、方法。通過60Coγ射線照射昆明小鼠，照射劑量7Gy，吸收劑量率為1.45Gy/rain，建立小鼠骨髓型急性放射損傷的動物模型；制備骨髓細胞懸液，利用Ficoll密度梯度離心法，分離、純化骨髓單個核細胞，統(tǒng)計細胞數(shù)量的變化。結(jié)果，小鼠受到輻射后，骨髓單個核細胞數(shù)與正常組相比，有非常顯著的差別(P＜0.01)，經(jīng)重組人骨形成蛋白成熟肽-4治療后，骨髓單個核細胞數(shù)高于照射組(P＜0.05)。 2.重組人骨形成蛋白成熟肽-4對輻射小鼠

10、外周血白細胞變化的影響。小鼠受到60Coγ射線照射后，經(jīng)rhBMP-4m治療，檢測外周血白細胞數(shù)。結(jié)果：輻射后小鼠外周血白細胞數(shù)與正常組相比，有非常顯著的差別(P＜0.01)，經(jīng)重組人骨形成蛋白成熟肽-4治療后，外周血白細胞數(shù)高于照射組(P＜0.01)。 3.重組人骨形成蛋白成熟肽-4對輻射小鼠骨髓CD34+細胞變化的影響。小鼠受到60Coγ射線照射后，經(jīng)rhBMP-4m治療，利用流式細胞儀(FCM)，檢測骨髓單個核細胞中CD3

11、4+細胞比例，比較對照組和治療組之間的差別。結(jié)果：骨髓單個核細胞中CD34+細胞所占比例明顯低于正常組(P＜0.01)：經(jīng)重組人骨形成蛋白成熟肽-4治療后，骨髓單個核細胞中CD34+細胞所占比例高于照射組(P＜0.05)。 4.重組人骨形成蛋白成熟肽-4對輻射小鼠脾臟表面CFU-S形成的影響。小鼠受到60Coγ射線照射后，經(jīng)rhBMP-4m治療后，于第9天解剖并取出其脾臟組織，用固定液固定24h后，觀察其脾臟表面，發(fā)現(xiàn)治療組脾臟

12、表面生成有較多的結(jié)節(jié)(CFU-S)，而對照組很少。結(jié)果：治療組小鼠脾結(jié)節(jié)數(shù)及脾體比均明顯高于對照組(P＜0.01)。 5.重組人骨形成蛋白成熟肽-4對輻射小鼠30天存活率的影響。小鼠受到60Coγ射線照射后，rhBMP-4m治療組30天存活率為35％；而對照組存活率僅10％。治療組明顯高于對照組。 本課題的實驗結(jié)果表明，小鼠經(jīng)60Coγ射線照射后，骨髓造血功能受到損傷，通過重組人骨形成蛋白成熟肽-4治療，能夠促進骨髓單個