TFDP3的表達調控及其對前列腺癌PC3細胞凋亡的影響.pdf

1、前列腺癌(prostate cancer,PCa)在男性腫瘤中具有很高的發(fā)病率,在美國已成為男性癌癥死因中僅次于肺癌的第二大殺手[1]。傳統(tǒng)的臨床前列腺癌治療方法包括雄激素阻斷治療、手術治療和藥物去勢治療等。但是隨著時間的推移,幾乎全部患者的前列腺癌類型都將由激素依賴性轉變?yōu)榉且蕾囆?也就是激素非依賴性前列腺癌(androgen independent prostate cancer,AIPC),使得原本激素依賴性的癌細胞增殖加速而不受

2、低雄激素水平抑制,最終促進了前列腺癌的進展或轉移。到目前為止,對AIPC還尚未發(fā)現有效的治療辦法。但隨著現代分子生物學的發(fā)展,基因治療將有望成為癌癥治療的新的有效手段。因此闡明前列腺癌的分子發(fā)病機制及轉錄調控機理具有重要的科學和臨床意義。
　　TFDP3是一個新的E2F1的直接調控因子。本課題組前期應用組織芯片和原位雜交方法進行了正常組織和癌組織的TFDP3表達分析。實驗證明,該基因并非所謂的睪丸/腫瘤特異的癌基因,而是廣泛表達于

3、多種組織細胞。同時,它的確在多種癌組織中表達增強,尤其是相對于正常情況下不表達TFDP3的肝和前列腺組織中。研究表明TFDP3不僅可以抑制E2F1誘導的細胞增殖活性,而且可以抑制E2F1誘導的細胞凋亡的作用;可以誘導前列腺癌細胞的自噬作用;提高激素依賴的前列腺癌細胞LNCap的生存能力。TFDP3誘導的自噬功能和抗凋亡效應極有可能是前列腺癌由激素依賴性向非依賴性轉變過程中的關鍵的自我保護機制之一。
　　本研究通過進一步對TFDP3

4、啟動子區(qū)轉錄結合位點的分析,發(fā)現TFDP3可能與E2F1轉錄因子結合。在此基礎上,本課題首先我們構建了包含TFDP3基因啟動子的熒光報告載體,從啟動子水平證實了轉錄因子E2F1對TFDP3的調控作用,其次通過western-blot初步探索TFDP3在E2F1刺激下的蛋白水平的變化,并且利用流式細胞術在功能水平上證實了TFDP3與E2F1的相互作用對前列腺癌細胞凋亡所造成的影響。最后,通過免疫組化分析前列腺癌組織和正常組織中TFDP3和

5、E2F1的表達水平,證明TFDP3和E2F1在前列腺癌組織中的表達水平相較于正常組織的表達水平均增高;同時,隨著前列腺癌等級的增高,二者的表達水平也增強,并且增高的趨勢相一致。
　　主要研究結果如下:
　　1.首先,通過NCBI基因組數據庫查找到TFDP3基因ATG上游約1064bp序列,并針對此序列設計引物。以人的前列腺癌PC3細胞基因組DNA為模板,采用 PCR技術擴增TFDP3啟動子片段并克隆到 pGL3-Basic熒

6、光素酶報告基因上游多克隆位點處,在此基礎上構建包含 TFDP3基因啟動子和熒光素酶報告基因的重組載體pGL3-TFDP3-promoter。最后,將構建的重組載體 pGL3-TFDP3-promoter轉染 PC3細胞后,檢測熒光素酶的表達活性,以驗證克隆的片斷存在TFDP3的啟動子序列或轉錄調控序列。
　　進一步與E2F1表達載體共轉染PC3細胞后,TFDP3啟動子誘導的熒光素酶活性較單獨轉染pGL3-TFDP3-promote

7、r顯著升高(1.14±0.06 vs0.61±0.05,P<0.05),證明E2F1可誘導TFDP3轉錄。
　　2.通過轉染E2F1表達載體pCMV-E2F1-HA于PC3細胞中,提取蛋白后,經Western blot檢測,得到以下實驗結果:相比未轉染組,轉染E2F1表達載體組的E2F1和TFDP3的表達均有所增加,IOD(TFDP3)/IOD(β-actin)約增加2.7倍(0.089±0.02vs0.24±0.03,P<0.0

8、5)。可見E2F1對TFDP3的蛋白表達具有上調作用。
　　3.通過流式細胞儀檢測 TFDP3與 E2F1相互作用對前列腺癌細胞凋亡的影響可以發(fā)現:轉染 E2F1表達載體后細胞凋亡率顯著上升(2.66％±0.001 vs7.1%±0.003,P<0.05),而與pcDNA3.1-TFDP3共轉染后細胞凋亡率明顯下降(7.1%±0.003 vs4.92%±0.002,P<0.05)。因此,進一步驗證了TFDP3可以在一定程度上抑制由

9、 E2F1誘導的前列腺癌細胞凋亡。
　　4.通過免疫組化檢測前列腺癌組織標本以及正常前列腺組織標本中 TFDP3和E2F1的表達情況,結果顯示:相較正常前列腺組織,前列腺癌組織中TFDP3和E2F1的表達水平均增強,同時隨著前列腺癌等級的增高,TFDP3和E2F1的表達也隨之增長,并且二者的增長趨勢相一致。
　　綜上所述,本研究通過構建TFDP3啟動子區(qū)熒光報告載體pGL3-TFDP3-promoter,并利用雙熒光素酶檢測

10、系統(tǒng)及 Western blot初步確定E2F1對TFDP3基因啟動子區(qū)具有轉錄水平和表達水平的調控作用,證明了E2F1參與該基因表達調控。此外通過免疫組化檢測正常前列腺組織和前列腺癌組織中TFDP3和E2F1表達水平,并結合流式細胞術檢測證實TFDP3可以結合E2F1進而有效抑制前列腺癌細胞的凋亡,從而在保障前列腺癌細胞生存中發(fā)揮了重要作用。這一現象提示TFDP3可能通過抑制激素缺失條件下前列腺細胞的凋亡,從而促進前列腺癌細胞的生存。