CHO-MBLw、CHO-MBLm52、CHO-MBLm54、CHO-MBLm57高表達株篩選及產(chǎn)物生物學特性研究.pdf

1、甘露聚糖結合凝集素(mannan-bindinglectin,MBL)是哺乳動物C型凝集素超級家族中膠凝素家族成員,主要由肝細胞分泌,作為糖蛋白存在于血漿中。MBL通過與2個MBL,相關絲氨酸蛋白酶(MBLassociatedserineprotease,MASP-1,MASP-2)結合而激活補體凝集素途徑,在天然免疫中發(fā)揮重要作用。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)3個可導致血清(漿)MBL水平低下并進而引起調(diào)理吞噬缺損的MBL結構基因點突變:CGT52TGT

2、、GGC54GAC和GGA57GAA,其編碼產(chǎn)物的改變分別是Arg→Cys、Gly→Asp及Gly→Glu。這些點突變?yōu)槌Ｈ旧w顯性遺傳,其基因頻率在不同種族人群中差異甚大,但總體來說極高,如第52位密碼突變在所研究過的人群中相對較低(≤0.1),第54位密碼突變在歐亞人群中有較高頻率(0.11～0.14),而第57位密碼突變在撒哈拉非洲人群中的頻率很高(0.23～0.29)。顯然,MBL缺損是迄今所發(fā)現(xiàn)的最常見的遺傳性免疫缺損病,而各

3、種病原體的反復感染與MBL缺損密切相關。然而,MBL基因突變引起免疫缺損的機理迄今尚未完全清楚。
　　 本課題組曾將相同質(zhì)量數(shù)的野生型和3種突變型MBL真核表達載體用脂質(zhì)體法分別轉染入相同數(shù)目的COS7細胞中,72h后檢測各目的蛋白的分泌量。將4種(1種野生型基因轉染COS7和3種突變型基因轉染COS7)細胞培養(yǎng)上清中檢測出的蛋白進行One-wayANOVA分析,發(fā)現(xiàn)4種細胞培養(yǎng)上清中目的蛋白的量沒有顯著性差異(P>0.05),

4、由此證明,MBL結構基因點突變并不影響MBL蛋白的合成與分泌。
　　 既然MBL結構基因點突變并不影響蛋白的合成與分泌,那是什么因為導致了血清(漿)MBL水平低下,是突變蛋白結構不穩(wěn)定還是功能異常?為了進一步闡明MBL的結構與功能的關系,揭示MBL缺損的實質(zhì),我們需要得到野生型和突變型MBL基因的穩(wěn)定表達產(chǎn)物,以便研究其生物學特性。在本研究中,我們將本室保存的已轉染4種真核表達載體(pcDNA4/HisMaxC-MBLw、pcD

5、NA4/HisMaxC-MBLm52、pcDNA4/HisMaxC-MBLm54和pcDNA4/HisMaxC-MBLm57)的CHO細胞株(CHO-MBLw、CHO-MBLm52、CHO-MBLm54和CHO-MBLm57)進行為期2個月的篩選,通過雙抗體夾心ELISA技術篩選得到了高效穩(wěn)定表達目的蛋白的單克隆細胞株,并對其表達的蛋白產(chǎn)物進行了較為深入的研究。將轉染空載體pcDNA4/HisMaxC的CHO細胞進行平行處理,作為陰性對

6、照,命名為CHO-pcDNA4C。
　　 一、雙抗夾心ELISA體系的建立建立了兩種雙抗體夾心ELISA體系,用于檢測培養(yǎng)上清中目的蛋白的濃度,篩選高效表達株。第一種夾心體系:利用MBL是多聚體的特性,捕獲抗體為鼠抗人MBL-CRDmAb,檢測抗體為Biotin-抗MBL-CRDmAb,推測由于空間位阻的關系,該體系檢測靈敏度不夠,僅為2.5mg/L；第二種夾心體系:捕獲抗體為鼠抗人MBL-CRDmAb,檢測抗體為商品化HRP-

7、抗HisG單克隆抗體,該體系靈敏度為0.3mg/L。檢測用標準品均為野生型重組人MBL蛋白。
　　 二、野生型和突變型MBL基因轉染CHO細胞穩(wěn)定高效表達株的篩選本課題組前期工作已成功構建含有4種真核表達載體的CHO細胞,即CHO-MBLw、CHO-MBLm52、CHO-MBLm54和CHO-MBLm57。將上述細胞分別復蘇后,在96孔板中單克隆化,待細胞克隆長至孔底的1/4后,挑取細胞株置12孔板內(nèi)培養(yǎng)24h后,以800mg/

8、L的Zeocin加壓篩選。隨后的1個月中,每隔3～5天換液一次,維持Zeocin濃度為800mg/L。分別得到4、1、2、5株穩(wěn)定高效單克隆細胞株,ELISA檢測上清中目的蛋白濃度均達到1～2mg/L。RT-PCR分析表明,轉染4種MBL基因的CHO細胞均穩(wěn)定轉錄mRNA。
　　 三、野生型和突變型MBL蛋白的純化及其生物學特性研究利用鼠抗人MBL-CRDmAb親和層析柱初步純化表達產(chǎn)物,Ni2+-NTAagarose層析柱進一

9、步純化表達產(chǎn)物,獲得野生型和突變型重組MBL蛋白。在1L培養(yǎng)上清中均獲得1mg左右的目的蛋白。經(jīng)Westernblot和ELISA鑒定,純化后的蛋白產(chǎn)物可分別與抗MBL-CRD單克隆抗體、抗His單克隆抗體和抗MBL單克隆抗體結合。它們分別命名為野生型MBL蛋白和32Cys、34Asp、37Glu突變型MBL蛋白。通過SDS-PAGE和Westernblot分析,發(fā)現(xiàn)重組突變MBL蛋白以雙鏈(Mr約55000)為主,而重組野生型MBL分

10、子則以二至六聚體(Mr150000～450000)為主。結果表明,突變蛋白的多聚化程度遠遠低于野生型MBL蛋白。酵母菌凝集試驗顯示:人血漿天然MBL和野生型MBL蛋白能結合酵母菌細胞壁甘露聚糖,產(chǎn)生可見的凝集顆粒,3種突變型MBL蛋白凝集顆粒極少；配體結合實驗表明,只有天然MBL和重組野生型MBL蛋白才能與甘露聚糖有效結合,3種突變型MBL,蛋白與糖結合的功能低下；補體C4d沉積試驗顯示,3種突變型MBL蛋白不能通過凝集素途徑激活補體系