生物樣品中C60含量的熒光分析研究.pdf

1、1985年Kroto等人在研究激光蒸發(fā)石墨的過程中發(fā)現(xiàn)了C60,由于其獨特的結構而具有特殊的理化性質。目前,C60及其衍生物已廣泛用于抑制蛋白和酶的活性、切割DNA和光動力學治療、清除自由基和作為靶向制劑的載體等,在生物和醫(yī)學領域展現(xiàn)出巨大的潛力。然而,對于C60進入生物體內(nèi)行為的研究還為數(shù)不多,而且C60多數(shù)是以納米顆粒存在于分散液中,進入體內(nèi)后會在不同的組織器官中發(fā)生沉積,對生物體產(chǎn)生一定的毒害損傷。因此需要系統(tǒng)研究C60在生物體內(nèi)

2、的分布、代謝以及定量情況,而對生物樣品中C60的含量測定是研究其在體內(nèi)行為的一個重要方面,本文從以下幾個部分來研究C60的含量測定及與蛋白相互作用。
　　 ⑴肝癌細胞內(nèi)C60含量測定。實驗采用安全濃度范圍內(nèi)的泊洛沙姆(10％polo)分散C60,得到穩(wěn)定的C60分散液。對C60分散液熒光性質進行考察,得到最佳的激發(fā)和發(fā)射波長分別在220 nm和371 nm處。實驗中培養(yǎng)肝癌細胞的培養(yǎng)液中含有胎牛血清,而胎牛血清在波長300-50

3、0 nm處有熒光發(fā)射,對C60分散液的含量測定產(chǎn)生干擾。另外,消化細胞時所用的胰酶主要由胰蛋白酶、胰淀粉酶與胰脂肪酶組成,同樣在C60分散液的熒光測定范圍內(nèi)有熒光發(fā)射,影響測定。因此需要對樣品進行處理以排除這些干擾。實驗通過以PBS代替培養(yǎng)基吹打細胞,多次離心去除胰酶的干擾;采用碳超破碎細胞后離心,去除細胞內(nèi)源物質的干擾,使得該熒光光譜法得到較好的測定結果。實驗結果表明,C60在1.28-46.03 mg/L濃度范圍內(nèi)線性關系良好,肝癌

4、細胞裂解液中C60平均回收率為86.5%,RSD為10.8%。
　　 ⑵C60與牛血清白蛋白相互作用研究。實驗中發(fā)現(xiàn),使用文獻報道過的方法處理血樣后,空白血樣在熒光分光光度計上掃描得到的熒光強度高于含C60的血樣的熒光強度,使用陽離子表面活性劑CTAB處理血樣也出現(xiàn)了同樣的情況。因此以牛血清白蛋白為模型,通過實驗進一步計算C60與牛血清白蛋白的淬滅及結合常數(shù)可以得出C60與牛血清白蛋白之間產(chǎn)生了一定的相互作用,并且影響了牛血清白

5、蛋白的結構。初步推測是由于牛血清白蛋白構象的改變致使其水溶性降低,在離心的過程中將C60一同離心到沉淀中,而使上層清液中存在的C60含量減少從而導致熒光分光光度計無法檢測出C60的信號。實驗結果表明,C60水溶液對牛血清白蛋白有熒光淬滅作用,兩者結合常數(shù)在104 L/mol數(shù)量級以上,結合位點接近于色氨酸殘基。根據(jù)熱力學參數(shù)推斷C60水溶液與牛血清白蛋白有可能是通過疏水作用力相互結合。實驗中采用溶劑置換(甲苯與水)的方法制備C60水溶液

6、,加入表面活性劑對C60的分散及熒光強度沒有明顯的增強效果。同時考察了C60水溶液的濃度確定方法,使用NaCl破壞C60水溶液穩(wěn)定性,甲苯提取率達到98%以上,可以認為此方法能夠提取完全。
　　 ⑶血清中C60含量測定。曾有文獻報道采用HPLC法測定血樣中C60的含量,測定的準確度較高,但是由于血樣處理過程較為復雜而且使用甲苯作為流動相,對操作者和儀器均有較大損害,同時樣品損失較大,測定結果不能真實反映體內(nèi)C60含量。本實驗采用