應用二硫鍵捕獲型單鏈三聚體技術制備PR1-HLA-A-0201四聚體.pdf

1、細胞毒T淋巴細胞(Cytotoxic TLymphocytes，CTL)是機體抗腫瘤、抗移植物及有效控制各種感染的重要免疫防御效應細胞，定量檢測抗原特異性CTL一直是免疫學界努力目標之一。
　　T細胞是通過TCR識別靶細胞或抗原遞呈細胞表面MHC分子結合的特異性表位肽復合體，但這種特異性識別親和力低，迅速發(fā)生解離。MHC-Ⅰ四聚體技術正是基于TCR與抗原肽-MHC-Ⅰ的特異性相互作用，利用生物素-親和素結合的原理，在體外將MHC-

2、Ⅰ分子及其所遞呈的抗原肽組裝成抗原肽-MHC-Ⅰ四聚體復合物。MHC-Ⅰ四聚體復合物增強了MHC-Ⅰ分子與T細胞受體的親和力，借助流式細胞技術可以對結合有抗原肽-MHC-Ⅰ四聚體的T細胞進行檢測和分離。但后來發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)四聚體制備流程復雜，成本高，加之復性效率低，特別是對于與MHC分子低親和力的抗原肽，極難形成穩(wěn)定的pMHC-Ⅰ單體，這些缺陷限制了四聚體技術的應用。
　　MHC-Ⅰ單鏈三聚體技術(single chain trimer

3、，SCT)的出現(xiàn)一舉解決了上述問題，它是將抗原肽、β2m和MHC-Ⅰ分子以適當?shù)慕宇^(linker)依次串聯(lián)而成，只需克隆表達一次，純化一次，大大簡化了制備過程，而且得率較傳統(tǒng)四聚體高得多，大大降低了成本。更為重要的是，MHC-Ⅰ SCT可以使抗原肽與MHC分子的結合更加穩(wěn)定，本質上是增加了一個再結合的過程，是一個補償效應，這使得四聚體技術的使用范圍擴大至某些與MHC分子較低親和力的抗原肽。但是，如果抗原肽與SCT的抗原結合槽的結合能力

4、低到一定程度，也會有被取代的危險。出于這方面的考慮，我們對SCT進行了改進，引入“二硫鍵”，使得抗原肽更牢固地錨定在抗原結合槽內。
　　慢性髓細胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是一種髓系造血干細胞惡性增生性疾病，目前仍缺乏有效的根治方法，過繼性細胞免疫治療成為了理想的方法。PR1為來自CML相關抗原蛋白酶3的HLA-A*0201限制性9肽(VLQELNVTV)，其誘導的CTLs可殺傷白血病細胞，

5、但對正常骨髓細胞無毒性。本實驗改造的PR1-HLA-A*0201-dtSCT四聚體旨在提高PR1特異性CTL的檢出率，期望成為CML研究中的有力工具。
　　本研究中，我們首先利用基因工程技術對實驗室已有的PR1-HLA-A*0201 SCT融合基因載體進行改造，在PR1肽、β2m及HLA*0201以柔性linker依次串聯(lián)的基礎上，運用SOE-PCR的方法將A2分子的“肽C末端結合區(qū)”的第84位氨基酸由酪氨酸(Tyr)突變?yōu)榘腚装?/p>

6、酸(Cys)，同時在linker1中引入一個Cys，兩個半胱氨酸殘基形成一個二硫鍵，使抗原肽C末端更好地錨定，確保抗原肽和抗原結合槽的穩(wěn)固結合。再將改造后的PR1-HLA-A*0201-dtSCT融合基因，克隆到pET22b載體中進行原核表達，通過洗滌包涵體獲得大量改造后的PR1-HLA-A*0201-dtSCT包涵體蛋白。然后對改造后的PR1-HLA-A*0201-dtSCT包涵體蛋白進行純化、折疊復性、超濾截留，再將其生物素化，根據(jù)

7、生物素化效率，按照4.5∶1摩爾比和PE標記的鏈霉親和素結合，形成一個標記熒光素的PR1-HLA-A*0201-dtSCT四聚體。
　　通過流式檢測CML臨床標本，發(fā)現(xiàn)PR1-HLA-A*0201-dtSCT四聚體在PR1-CTL的檢出率上明顯優(yōu)于未改造的PR1-HLA-A*0201-SCT四聚體，并且治療后的CML病人體內PR1-CTL的頻數(shù)要比未經(jīng)過治療的病人高，兩者存在顯著性差異。在對PR1-CTL這群特異性細胞的分析中發(fā)現(xiàn)