線粒體DNA常見缺失在大片段缺失突變中的作用及其發(fā)生機(jī)制.pdf

1、第一部分：
　　 目的：研究D-半乳糖模型大鼠內(nèi)耳組織中可能存在的線粒體DNA大片段缺失突變。
　　 方法：1月齡雌性Wistar 大鼠48只隨機(jī)分為4組：低、中、高劑量D-半乳糖組和生理鹽水對(duì)照組各12只，分別于每日皮下注射5％D-半乳糖150 mg/kg、300 mg/kg、500 mg/kg和等體積生理鹽水，共8周。聽性腦干反應(yīng)（ABR）檢測大鼠聽閾。聯(lián)合應(yīng)用普通PCR、巢式PCR和長片段PCR技術(shù)篩查大鼠內(nèi)耳組織

2、中的線粒體DNA大片段缺失突變。應(yīng)用DNA測序技術(shù)證實(shí)線粒體DNA缺失突變的存在。
　　 結(jié)果：D-半乳糖組大鼠與對(duì)照組之間ABR 閾移差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 不同劑量D-半乳糖組大鼠內(nèi)耳組織中均可檢測出線粒體DNA4834 bp 缺失突變，并且首次發(fā)現(xiàn)3 種新的線粒體DNA缺失突變。線粒體DNA4834 bp 缺失突變和3 種新發(fā)現(xiàn)的缺失突變的斷裂融合位點(diǎn)兩端均存在核苷酸重復(fù)序列，并且均涉及線粒體編碼的細(xì)胞色素C 氧

3、化酶亞基III （COX3）基因。
　　 結(jié)論：D-半乳糖模型大鼠內(nèi)耳組織中存在多種線粒體DNA大片段缺失突變，這些缺失突變存在相似的特征。
　　 第二部分：
　　 目的：探討線粒體DNA4834 bp 缺失突變?cè)诖笃稳笔蛔冎械呢暙I(xiàn)率，以及大片段缺失突變對(duì)缺失突變熱點(diǎn)區(qū)域的細(xì)胞色素C 氧化酶（COX）活性的影響。
　　 方法：應(yīng)用Taqman 探針法實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測不同劑量D-半乳糖組大鼠內(nèi)耳組

4、織的線粒體DNA4834 bp 缺失突變率、線粒體DNA大片段缺失突變率及線粒體DNA拷貝數(shù)目。比色法定量檢測細(xì)胞色素C 氧化酶（COX）活性變化。
　　 結(jié)果：與對(duì)照組相比，三個(gè)不同劑量D-半乳糖組大鼠內(nèi)耳組織中線粒體DNA4834 bp 缺失突變率和線粒體DNA大片段缺失突變率明顯增高，其中高劑量D-半乳糖組升高最明顯。低、中、高劑量D-半乳糖組大鼠內(nèi)耳組織中線粒體DNA4834 bp 缺失在線粒體DNA大片段缺失突變中所占

5、比例逐漸減少，分別為76.71±1.96％，74.94±2.04％，67.86±2.38％，而對(duì)照組為87.74±3.52％；D-半乳糖各劑量組內(nèi)耳組織的線粒體拷貝數(shù)目與對(duì)照組相比均明顯增高，并隨D-半乳糖劑量增大而顯著增高；COX 活性與對(duì)照組相比均明顯降低，并隨D-半乳糖劑量增大而顯著降低。
　　 結(jié)論：線粒體DNA4834 bp 缺失突變是D-半乳糖大鼠模型內(nèi)耳組織中的一種最主要的線粒體DNA大片段缺失。此缺失突變可考慮作

6、為評(píng)估內(nèi)耳組織線粒體DNA損傷的理想的分子標(biāo)志物。
　　 第三部分：
　　 目的：探討大鼠內(nèi)耳組織線粒體DNA缺失突變可能的發(fā)生機(jī)制。
　　 方法：88只雄性Wistar 大鼠隨機(jī)分為4組：低、中、高劑量D-半乳糖組和生理鹽水對(duì)照組各12只，分別于每日皮下注射5％D-半乳糖150 mg/kg、300 mg/kg、500mg/kg和等體積生理鹽水，共8周。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測各組大鼠內(nèi)耳組織中線粒體DNA48

7、34 bp 缺失突變率和線粒體DNA相對(duì)拷貝數(shù)目。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)和Western blotting 方法檢測各組大鼠內(nèi)耳組織中線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（TFAM）、DNA聚合酶γ（DNApol γ）和DNA修復(fù)酶8-氧鳥嘌呤糖苷酶（OGG1）在基因和蛋白水平的變化。
　　 結(jié)果：與對(duì)照組相比，D-半乳糖組大鼠內(nèi)耳組織中線粒體DNA4834 bp 缺失率和線粒體DNA相對(duì)拷貝數(shù)目明顯增高，高劑量組升高最明顯。D-半乳糖各劑量