DMD基因缺失突變及連接片段應用于基因診斷的研究.pdf

1、南方醫(yī)科大學博士學位論文DMD基因缺失突變及連接片段應用于基因診斷的研究姓名：鐘敏申請學位級別：博士專業(yè)：神經(jīng)病學指導教師：陸兵勛;潘速躍20090516摘要研究對象：6 例經(jīng)證實的缺失型D M D ／B M D 患者。其中病例1 、病例2 、病例3 、病例4 為D M D ，病例5 、病例6 為B M D ，來自同一家系，故實際互相無血緣關(guān)系的研究對象為5 例。抽提制備以上患者外周血基因組D N A 。D M D 基因缺失突變的閱讀框

2、檢測：通過外顯子P C R 檢測確定病例1 為D M D基因第4 6 “ 5 0 外顯子缺失，病例2 為第5 1 “ 一5 5 外顯子缺失，病例3 為第3 1 ～4 3 外顯子缺失，病例4 為第4 5 “ ～5 4 外顯子缺失，相同家系的病例5 、病例6 為第3 “ - 5 外顯子缺失。采用在線程序?qū)σ陨? 例研究對象進行外顯子缺失的閱讀框檢測，判斷其缺失突變所致可讀框改變類型。連接片段的克隆和測序：在研究對象D M D 基因缺失斷裂點

3、所在的相應內(nèi)含子上每間隔一定距離( 一般為3k b ) 設(shè)計l 對引物，通過P C R 步移的方法定位相應內(nèi)含子上的斷裂點位點。對5 例研究對象內(nèi)含子上斷裂點位點成功定位后，分別在靠近其上下游斷裂點處各設(shè)計1 對配對引物，以直接對各例連接片段進行長片段P C R 擴增，將擴增成功的P C R 產(chǎn)物純化后測序。連接片段的序列特點分析：對所測5 例中國人連接片段5 ’端和3 ’端斷裂點兩側(cè)的序列進行重復序列、基質(zhì)附著區(qū)( m a t r i

4、 x a t t a c h m e n t r e g i o n s ，M A R s ) 、回文序列、T T T A A A 序列以及基因缺失后修復方式的分析。3 ．結(jié)果6 例病例基因型和表型的關(guān)系：經(jīng)檢測病例1 、病例2 、病例3 、病例4 的缺失突變均屬框外缺失( o u t ．o f - f r a m ed e l e t i o n ) ，為改變遺傳信息可讀框的移碼突變，其相應的I 瞄床表型均為D M D 。同一家系的病

5、例5 、病例6 的缺失突變屬框內(nèi)缺失( i n - f r a m e d e l e t i o n ) ，為缺失下游仍然保持正?？勺x框的整碼突變，其相應的臨床表型為B M D 。5 例中國人連接片段的序列特點：分析發(fā)現(xiàn)J U N C T I O N l 的5 ’端斷裂點位于第4 5 內(nèi)含子L I N E ／L 1 序列內(nèi)，鄰近M A R ，附近存在回文序列，其3 ’端斷裂點鄰近第5 0 內(nèi)含子的M A R g J U N C T I