乙型肝炎病毒相關(guān)慢性肝炎、肝硬化及原發(fā)性肝癌的血清蛋白組學(xué)研究.pdf

1、目的：旨在利用Ciphergen公司的蛋白質(zhì)芯片飛行時間質(zhì)譜儀系統(tǒng)，選擇弱陽離子交換芯片(wcak cationic exchanger,WCX，CM10芯片為WCX芯片表面加上一層疏水膜，可以結(jié)合更多的蛋白，故實驗中選用CM10芯片)，檢測HBV相關(guān)慢性肝炎、肝炎肝硬化及原發(fā)性肝癌患者血清的蛋白質(zhì)表達(dá)譜，分析各組蛋白質(zhì)圖譜差異，以期發(fā)現(xiàn)慢性肝病進(jìn)展過程中不同階段的差異性蛋白。并對各組蛋白質(zhì)圖譜進(jìn)行聚類分析，通過決策樹建立疾病預(yù)測模型。

2、為進(jìn)一步明確差異蛋白的特性及功能，將其分離、純化后在芯片上進(jìn)行原位酶解，對差異蛋白進(jìn)行鑒定及功能分析，以探討其在乙型肝炎病毒相關(guān)慢性肝病中的作用，早期發(fā)現(xiàn)疾病的進(jìn)展，尋找阻斷慢性肝炎向肝硬化、肝癌發(fā)展的新思路。 實驗方法： 采用美國Ciphergen Biosystems公司的蛋白質(zhì)生物芯片表面增強(qiáng)激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)技術(shù)和PBS Ⅱ-C型蛋白質(zhì)芯片閱讀機(jī)，通過弱陽離子交換芯片(CM10)

3、對32例正常人、85例HBV相關(guān)慢性肝炎、30例HBV相關(guān)肝硬化和26例HBV相關(guān)肝癌術(shù)前患者的血清分別進(jìn)行檢測并讀取數(shù)據(jù)，獲得血清蛋白指紋圖譜，對得到的蛋白質(zhì)圖譜，使用Ciphergen Biosystems軟件3.1.1版本及Biomarker Wizard軟件進(jìn)行分析、比較，以尋找慢性肝病進(jìn)展過程中的差異蛋白。對正常、慢性肝炎、肝硬化及原發(fā)性肝癌患者血清圖譜進(jìn)行聚類分析，通過決策樹建立疾病預(yù)測模型。進(jìn)一步將肝癌患者及對照組血清通過

4、U9、U1處理后，上離子交換柱，用不同pH Tris緩沖液洗脫，收集各組分；用NP20芯片挑選含有特征峰的組分，然后用CM10芯片驗證含有特征峰的組分，芯片原位酶解后，PMF質(zhì)譜鑒定。 實驗結(jié)果： 由CM10芯片共檢測到294個有效的蛋白質(zhì)波峰，其中m/z值在1000～10000Da之間有253個；10000～20000 Da之間有23個；20000～30000 Da之間有18個。經(jīng)分析，在正常對照、HBV相關(guān)慢性肝炎、

5、肝硬化和肝癌組之間有18個差異蛋白峰(P<0.05)，其中差異最顯著的質(zhì)荷比為5805 Da的蛋白質(zhì)峰在由正常對照、慢性肝炎、肝硬化至肝癌的疾病進(jìn)展過程中表達(dá)量呈遞增趨勢，在肝癌組表達(dá)最高；質(zhì)荷比為13260 Da的蛋白質(zhì)峰在這個過程中呈遞減趨勢，在肝癌組表達(dá)最低。通過聚類分析同樣發(fā)現(xiàn)質(zhì)荷比為5805 Da的蛋白在正常、慢性肝炎、肝硬化和肝癌組間呈正相關(guān)，在肝癌組密度(即強(qiáng)度)最高。通過決策樹建立疾病預(yù)測模型，對乙型肝炎病毒相關(guān)慢性肝病

6、預(yù)測的平均正確率達(dá)73.9％。 對差異最顯著的質(zhì)荷比為5805 Da的蛋白通過離子交換柱分離、純化，在芯片上進(jìn)行原位酶解，PMF質(zhì)譜鑒定，SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫搜庫檢索，該蛋白鑒定為硫酸軟骨素合酶Ⅱ，屬于軟骨素N-乙酰半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶家族。 結(jié)論： 1．正常對照、乙型肝炎病毒相關(guān)慢性肝炎、肝硬化與肝癌組間血清蛋白圖譜表達(dá)差異顯著。 2．正常對照、乙型肝炎病毒相關(guān)慢性肝炎、肝硬化與肝癌組間有18個差異蛋