SDF-1-CXCR4通路在視網(wǎng)膜前體細胞遷移中作用的研究.pdf

1、視網(wǎng)膜神經(jīng)元變性是視網(wǎng)膜色素變性、老年黃斑變性、視網(wǎng)膜脫離等常見眼病造成視力損害的原因。移植體外培養(yǎng)的神經(jīng)干/前體細胞到病變損害的視網(wǎng)膜，取代變性的視網(wǎng)膜神經(jīng)元，是治療這一類型視網(wǎng)膜病變的有希望的途徑之一。移植的神經(jīng)干/前體細胞發(fā)揮功能的前提是移植細胞能夠從移植部位遷移到病變或損傷的部位。譬如，移植到玻璃體腔的神經(jīng)干細胞必須能夠從玻璃體腔向視網(wǎng)膜內遷移，并且穿透視網(wǎng)膜組織的各個屏障，比如內界膜，才有可能到達病變部位，與視網(wǎng)膜神經(jīng)元建立結

2、構和功能上的聯(lián)系，整合到視網(wǎng)膜神經(jīng)元環(huán)路，進而進一步分化為成熟神經(jīng)元并發(fā)揮功能。近年來研究表明，神經(jīng)干/前體細胞移植到大鼠玻璃體腔或視網(wǎng)膜下腔后，能夠準確地遷移到遭受病變損傷的部位。GrozdanicSD等把成年海馬回神經(jīng)干/前體細胞移植到新生或成年大鼠眼玻璃體腔，發(fā)現(xiàn)移植細胞能夠存活一定的時間并且一部份細胞能整合到宿主視網(wǎng)膜的板層結構。然而，同時又發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)干/前體細胞移植到成年動物眼內時，只有在視網(wǎng)膜病變或受到損傷時，才出現(xiàn)廣泛的遷

3、移和整合。這些研究提示，病變或損傷組織可能生成了某些細胞因子，為外來的神經(jīng)干前體細胞遷移到病變部位提供了某種“信號”，引導供體細胞向病變組織遷移。但損傷組織產(chǎn)生的這種指導移植細胞向病變部位遷移的細胞因子的性質是什么目前尚不清楚。 在損傷組織分泌的多種細胞因子中，基質細胞衍生因子(stromalcells-derivedfactor，SDF-1)目前被認為是最有可能引導干細胞遷移的一個。SDF-1最先被發(fā)現(xiàn)是白細胞、造血細胞及血管

4、內皮細胞的趨化劑，最近的研究發(fā)現(xiàn)SDF-1在調控胚胎發(fā)育過程中神經(jīng)干/前體的遷移以及腫瘤細胞的轉移中也起著至關重要的作用。為了證明SDF-1-CXCR4功能軸是否參與了指導移植細胞向受體視網(wǎng)膜病變部位遷移這一過程，本實驗檢測了SDF-1在三種損傷機理截然不同的視網(wǎng)膜損傷模型中的表達與時空分布特點。同時，為了證明SDF-1發(fā)揮作用的另一基礎，即CXR4(SDF-1的唯一受體)是否存在于供體細胞，我們檢測了體外擴增的視網(wǎng)膜前體細胞上CXCR

5、4的表達情況，并且檢查SDF-1對視網(wǎng)膜前體細胞的體外趨化作用。本研究證實，視網(wǎng)膜在經(jīng)受各種不同的損傷/病變時均產(chǎn)生炎癥趨化因子SDF-1，但在不同的損傷模型中有不同的時空表達特征。同時，體外擴增的視網(wǎng)膜前體細胞表達SDF-1的受體CXCR4，并且對SDF-1的趨化反應能力呈劑量依賴關系。這些實驗說明，SDF-1-CXCR4通路是指導移植細胞向病變部位遷移的途徑之一。實驗進一步證實，視網(wǎng)膜前體細胞在O2誘導下CXCR4受體表達增加，提示

6、視網(wǎng)膜前體細胞移植到體內后對SDF-1的趨化能力可能增強。 本研究分為以下四個部份： 第一部分SDF-1在損傷/病變的視網(wǎng)膜上的表達研究 目的：探討SDF-1在急性損傷和遺傳性視網(wǎng)膜變性損傷大鼠視網(wǎng)膜上的表達及時空分布特征。 方法：60天S-D大鼠37只，隨機分為缺血再灌注組(16只)、N-甲基-N-亞硝脲(N-methyl-N-nitrosourea，MNU)損傷組(16只)、和對照組(5只)。MNU損

7、傷組腹腔注射MNU60mg/kg體重一次，建立MNU誘導的大鼠視網(wǎng)膜損傷模型。缺血-再灌注損傷組前房110mmHG靜水壓持續(xù)60分鐘建立視網(wǎng)膜急性缺血-再灌注損傷大鼠模型。MNU損傷模型1d，3d、5d和7d后取材，缺血再灌注損傷大鼠再灌注后6小時、12小時、24小時和48小時取材。遺傳性視網(wǎng)膜變性RCS大鼠分為25天和50天組各10只，正常RCS鼠5只作為對照。末端脫氧核苷酸轉移酶介導dUTP缺口末端標記法(TUNEL)染色檢測不同時

8、間點模型鼠凋亡細胞的分布。RT-PCR檢測以上各時間點視網(wǎng)膜組織SDF-1和低氧誘導因子(Hypoxiainduced-factor，HIF-1)mRNA的表達，免疫組織化學法檢測SDF1蛋白在視網(wǎng)膜的表達。 結果：對照組未見TUNEL標記的陽性細胞。MNU作用1天后，視網(wǎng)膜外核層出現(xiàn)凋亡細胞，3天時增加最明顯。SDF-1mRNA的表達量在第3天達到高峰，SDF-1表達主要集中在視網(wǎng)膜外核層。視網(wǎng)膜缺血-再灌注損傷12小時后視網(wǎng)

9、膜內層出現(xiàn)TUNEL陽性細胞，24小時數(shù)量最多，SDF-1mRNA的表達量在24小時達到高峰。HIF-1mRNA在損傷后24小時表達量最高。SDF-1首先出現(xiàn)在視網(wǎng)膜內層小血管周圍，以后在視網(wǎng)膜內層擴散。25天和50天組RCS鼠視網(wǎng)膜均檢測到SDF-1mRNA，25天時表達高于50天。 結論：視網(wǎng)膜損傷時病變組織產(chǎn)生SDF-1，不同類型的損傷SDF-1表達持續(xù)時間不同。視網(wǎng)膜缺血-再灌注損傷時，SDF1表達可能受低氧誘導因子HI

10、F-1的調控。 第二部分全神經(jīng)球貼壁培養(yǎng)法體外擴增視網(wǎng)膜前體細胞 目的：視網(wǎng)膜前體細胞是視網(wǎng)膜移植的理想供體來源，本研究的目的是探尋一種既高效又能連續(xù)體外擴增視網(wǎng)膜前體細胞(RetinalProgenitorCells，RPCs)的培養(yǎng)方法。 方法：E17天小鼠胚胎視網(wǎng)膜細胞采取神經(jīng)球貼壁培養(yǎng)或直接貼壁培養(yǎng)法。神經(jīng)球貼壁培養(yǎng)時，先經(jīng)懸浮培養(yǎng)生成富含前體細胞的神經(jīng)球，然后將700rmp/min離心分離出的神經(jīng)球接種

11、到Poly-D-Lysine包被的培養(yǎng)瓶，在前體細胞培養(yǎng)液中(含F(xiàn)GF-2、EGF和LIF)貼壁培養(yǎng)，頭24小時在培養(yǎng)液中添加10％的胎牛血清。直接貼壁培養(yǎng)法是將細胞懸液直接接種到預先包被Poly-D-Lysine的培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。撤除前體細胞培養(yǎng)液中的分裂原，加入10％的胎牛血清和1uM的視黃酸誘導分化7天。細胞免疫組織化學和FACS分析神經(jīng)球貼壁培養(yǎng)細胞的干細胞特性和分化能力，并與直接貼壁培養(yǎng)法得到的細胞進行比較。 結果：神經(jīng)球

12、接種到預先包被Poly-D-Lysine的培養(yǎng)瓶后貼附到培養(yǎng)瓶底，神經(jīng)球周邊的細胞逐漸向外周延伸，留下扁平的細胞體，逐漸形成貼壁生長的單層細胞。該法能夠在體外長期擴增視網(wǎng)膜前體細胞，6個月內細胞能夠傳代10次以上。在RA誘導分化時，能夠生成成熟視網(wǎng)膜細胞，表達視網(wǎng)膜細胞特異性標記。FACS分析和免疫組化染色顯示神經(jīng)球貼壁培養(yǎng)所得細胞在未分化時Nestin陽性率(92％)細胞率以及分化為成熟視網(wǎng)膜細胞的比率(53.7％)，均高于直接貼壁培

13、養(yǎng)法獲得的細胞。 結論：神經(jīng)球貼壁培養(yǎng)法能夠在體外長期大量擴增視網(wǎng)膜前體細胞，能較好地保持干細胞特性，并容易分化為成熟的視網(wǎng)膜細胞，較直接貼壁培養(yǎng)具有較大的優(yōu)越性。 第三部分SDF-1對視網(wǎng)膜前體細胞的體外趨化作用 目的：分析體外培養(yǎng)的RPC上趨化因子受體CXCR4的表達以及其配體SDF-1對RPC的趨化作用。 方法：利用RT-PCR檢測神經(jīng)球貼壁培養(yǎng)法獲得的RPC上CXCR4受體mRNA的表達，熒光激活

14、細胞分類法(Florescent-activatedcellssort，F(xiàn)ACS)測定CXCR4陽性細胞率。激光共聚焦顯微鏡檢查CXCR4受體在RPC上的表達。Boyden小室實驗觀察0ng，40ng，60ng，100ng/ml濃度SDF-1對RPCs的趨化作用；劃痕試驗觀察SDF-1對RPC增殖和遷移的影響。 結果：RPC分化前后均表達CXCR4mRNA，F(xiàn)ACS表明CXCR4陽性細胞數(shù)占RPC總數(shù)的20％左右。SDF-1對R

15、PCs的趨化作用在一定范圍內隨SDF-1濃度的增加而增加。用Anti-CXCR4抗體封閉RPC上的CXCR4受體，SDF1對其趨化作用消失。劃痕實驗顯示SDF-1促進RPCs的增殖和遷移。 結論：體外擴增的視網(wǎng)膜前體細胞表達功能性CXCR4受體，SDF-1對CXCR4陽性RPC有趨化作用，趨化效率與SDF-1濃度呈劑量依賴關系。 第四部分缺氧誘導增加視網(wǎng)膜前體細胞表達CXCR4受體 目的：CXCR4及其配體SDF

16、-1組成的趨化軸在指導視網(wǎng)膜前體細胞向病變部位定向遷移的過程中可能起重要作用。增加RPC的CXCR4的表達率有可能增強干細胞的趨化活性，從而提高移植細胞的定向遷移能力?？紤]到干細胞移植到玻璃體腔或視網(wǎng)膜下腔后面臨的O2濃度遠低于體外培養(yǎng)環(huán)境，因此本文探討RPC在低氧培養(yǎng)時CXCR4受體表達情況。 方法：FACS檢測10％O2濃度培養(yǎng)24，36h和48h小時后，RPC中CXCR4陽性細胞百分比，RT-PCR檢測CXCR4和HIF-

17、1和mRNA的表達。Boyden小室實驗觀察60ng/ml的SDF-1對低氧培養(yǎng)不同時間的RPC的趨化效率。 結果：FACS檢測表明，低O2培養(yǎng)24，36h和48h小時后RPC中CXCR4陽性細胞率分別為19.6％、26.9％和46.1％，統(tǒng)計學分析差異有顯著性。在正常O2培養(yǎng)時未能檢測到HIF-1mRNA的表達，但低O2培養(yǎng)后HIF-1mRNA表達逐漸升高。Boyden小室實驗發(fā)現(xiàn)60ng/ml的SDF-1對低氧培養(yǎng)不同時間的