缺氧預(yù)適應(yīng)上調(diào)SDF-1-CXCR4的表達(dá)改善心臟祖細(xì)胞存活的機制研究.pdf

1、第一部分:
　　 c-kit陽性心臟祖細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)和純化
　　 目的:探索自成年小鼠心臟組織中分離培養(yǎng)得到c-kit陽性心臟祖細(xì)胞(cardiacprogenitorcells，CPCs)的有效方法。方法:無菌條件下取2月齡成年C57BL/6小鼠心臟，剪碎，經(jīng)膠原酶Ⅳ和胰蛋白酶消化后，置于組織塊培養(yǎng)基(completeexplantmedium，CEM)中培養(yǎng)。培養(yǎng)一段時間后，收集心肌組織塊周圍爬出的小、圓、亮的細(xì)

2、胞，通過磁珠分選儀c-kit磁珠抗體陽性分選獲得純化的c-kit陽性CPCs，然后按2×104/ml的密度種植在多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)皿中，予以心球生長培養(yǎng)基(cardiosphere-growingmedium，CGM)繼續(xù)培養(yǎng)生長。導(dǎo)致相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特點，免疫細(xì)胞化學(xué)染色法及流式細(xì)胞法分析所得細(xì)胞其表面祖細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)。結(jié)果:消化后的心肌組織塊經(jīng)過10天左右的培養(yǎng)，可見小、圓、亮的細(xì)胞出現(xiàn)在組織塊周圍爬出的成纖維細(xì)胞層上

3、。倒置顯微鏡下觀察分離培養(yǎng)獲得的CPCs可形成“太陽狀”集落，可分化成能自發(fā)性搏動的心肌細(xì)胞。免疫細(xì)胞化學(xué)染色示分離培養(yǎng)獲得的CPCs其表面c-kit表達(dá)陽性。流式細(xì)胞分析顯示經(jīng)過磁珠分選后c-kit陽性率為87.26％，而分選前c-kit表達(dá)陽性率僅6.5％。結(jié)論:聯(lián)合利用酶消化和磁珠分選法可以成功地從成年小鼠心臟組織中分離培養(yǎng)得到高純度的c-kit陽性心臟祖細(xì)胞。
　　 第二部分:
　　 缺氧預(yù)適應(yīng)時程對體外培養(yǎng)的C

4、PCs分子生物學(xué)功能的影響
　　 目的:觀察缺氧不同時間對體外培養(yǎng)的c-kit陽性CPCs的活力及分子生物學(xué)功能的影響，確定本研究系統(tǒng)中最佳的缺氧預(yù)適應(yīng)時間。方法:將c-kit+CPCs分為5組，正常氧培養(yǎng)組(Normoxia，Nx)，缺氧培養(yǎng)3小時組(Hypoxia，Hx3h)，缺氧培養(yǎng)6小時組(Hx6h)，缺氧培養(yǎng)12小時(Hx12h)，缺氧培養(yǎng)24小時(Hx24h)。流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞活力;Westernblot法檢測HI

5、F-1α，CXCR4，Bcl-2，p-Akt蛋白的表達(dá);ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)基上清中SDF-1α、VEGF的分泌量。結(jié)果:流式細(xì)胞檢測顯示與正常氧環(huán)境培養(yǎng)相比缺氧培養(yǎng)12小時以內(nèi)對c-kit+CPCs活力無顯著影響，其中缺氧培養(yǎng)6小時細(xì)胞活力最佳(Nx4.67±0.45，Hx6h4.47±0.31;P＞0.05)，但缺氧培養(yǎng)24小時后細(xì)胞凋亡率顯著增加(Nx4.67±0.45，Hx24h7.43±0.61;P＜0.01)。缺氧培養(yǎng)1

6、2小時以上細(xì)胞凋亡呈現(xiàn)出逐步上升的趨勢。Westemblot結(jié)果顯示缺氧培養(yǎng)后HIF-1α和CXCR4，促生存蛋白Bcl-2和p-Akt表達(dá)均較正常氧培養(yǎng)組顯著增加。ELISA檢測結(jié)果顯示培養(yǎng)液上清中的SDF-1α、VEGF含量在缺氧培養(yǎng)后也顯著升高。結(jié)論:6小時是c-kit+CPCs缺氧預(yù)適應(yīng)的最佳時程，此時CPCs的存活良好，抗凋亡能力最強。
　　 第三部分:
　　 缺氧預(yù)適應(yīng)對CPCs遷移和抗凋亡能力的影響及其與S

7、DF-1/CXCR4信號軸的關(guān)系
　　 目的:探索缺氧預(yù)適應(yīng)6小時后c-kit+CPCs體外遷移和抗凋亡能力的改變及其與SDF-1α/CXCR4軸的關(guān)系。方法:Transwell小室檢測細(xì)胞遷移能力，實驗分為4組，正常氧組(Nx)，正常氧+SDF-1α組(Nx+SDF-1α)，缺氧預(yù)適應(yīng)+SDF-1α組(Hx+SDF-1α)，缺氧預(yù)適應(yīng)+SDF-1α+AMD3100組(Hx+AMD+SDF-1α)。缺氧培養(yǎng)并血清剝奪48小時誘導(dǎo)

8、c-kit+CPCs凋亡。將體外培養(yǎng)的CPCs隨機分為4組:正常氧組(Nx)，正常氧+AMD3100組(Nx+AMD)，缺氧預(yù)適應(yīng)組(Hx)，缺氧預(yù)適應(yīng)+AMD3100組(Hx+AMD)。Annexin/碘化吡啶(PI)雙染色法流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果:缺氧預(yù)適應(yīng)后c-kit+CPCs遷移能力較正常氧組顯著增加（Nx+SDF-1α341±26，Hx+SDF-1α650±48;P＜0.01）。同樣，當(dāng)缺氧預(yù)適應(yīng)的c-kit+CPCs與

9、AMD3100共孵育時，這種由缺氧預(yù)適應(yīng)誘發(fā)的CPCs遷移能力增強效應(yīng)大部分被阻滯掉了（Hx+AMD+SDF-1α396±39，Hx+SDF-1α650±48;P＜0.01）。缺氧預(yù)適應(yīng)組CPCs凋亡率明顯低于正常氧培養(yǎng)組(Nx33.29±2.55，Hx21.81±1.67;P＜0.01)，但當(dāng)缺氧預(yù)適應(yīng)的c-kit+CPCs與AMD3100共孵育時，這種短時間缺氧誘發(fā)的保護性作用則基本被抵消了（Hx+AMD30.96±3.07，Hx2

10、1.81±1.67;P＜0.01）。結(jié)論:缺氧預(yù)適應(yīng)能增強c-kit+CPCs的遷移和抗凋亡能力，缺氧預(yù)適應(yīng)誘導(dǎo)的CPCs功能增強依賴于SDF-1/CXCR4信號通路信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
　　 第四部分:
　　 缺氧預(yù)適應(yīng)對CPCs移植治療急性心肌梗死的影響及其與SDF-1/CXCR4信號軸的關(guān)系
　　 目的:探索缺氧預(yù)適應(yīng)6小時的c-kit+CPCs移植治療小鼠急性心肌梗死的療效及其與SDF-1α/CXCR4軸的關(guān)系。方

11、法:結(jié)扎冠狀動脈左前降支建立小鼠急性心肌梗死模型，隨機分為對照組(Control)，正常氧組(Nx)，缺氧預(yù)適應(yīng)組(Hx)，缺氧預(yù)適應(yīng)+AMD3100組(Hx+AMD)。對照組小鼠僅心肌內(nèi)注射無細(xì)胞的DMEM，3個實驗組分別心肌內(nèi)注射移植正常氧培養(yǎng)、缺氧預(yù)適應(yīng)和缺氧預(yù)適應(yīng)+AMD3100處理后的c-kit+CPCs。細(xì)胞移植后7天心臟超聲檢查小鼠心功能，隨后處死小鼠取心臟標(biāo)本并做相應(yīng)檢查。結(jié)果:心臟超聲檢查結(jié)果顯示c-kit+CPCs移

12、植組心功能明顯優(yōu)于對照組(P＜0.01)。缺氧預(yù)適應(yīng)組心功能優(yōu)于正常氧組（P＜0.01），缺氧預(yù)適應(yīng)+AMD3100組心功能與正常氧組比較無顯著性差異。缺氧預(yù)適應(yīng)組梗死面積小于對照組及正常氧組（Control49.6±5.9;Nx37.9±5.0;Hx25.8±5.4;P＜0.01）;缺氧預(yù)適應(yīng)+AMD3100組心梗面積小于對照組（Hx+AMD37.5±3.7;P＜0.01），其梗死面積大于缺氧預(yù)適應(yīng)組(P=0.013)，但與正常氧組比

13、較沒有顯著差異。TUNEL熒光染色結(jié)果顯示缺氧預(yù)適應(yīng)組細(xì)胞凋亡明顯低于其他組(Control81.2±11.3;Nx47.8±6.5;Hx19.6±7.5;P＜0.01)，當(dāng)缺氧預(yù)適應(yīng)的細(xì)胞與AMD3100共孵育時，缺氧預(yù)適應(yīng)的保護性效應(yīng)就被抵消了（Hx19.6±7.5;Hx+AMD42.4±7.7;P=0.004）。缺氧預(yù)適組植入的CPCs凋亡率較正常氧組及缺氧預(yù)適應(yīng)+AMD3100組明顯降低（Hx30.9±5.1;Nx43.8±4.