轉(zhuǎn)錄因子FoxA1對干細胞多能性基因Nanog的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究.pdf

1、胚胎干細胞具有在體外自我更新和分化成所有三胚層來源的細胞的能力。廣義上的胚胎干細胞包括：一.從機體幼稚生殖細胞發(fā)生癌變形成的惡性畸胎瘤建立的胚胎癌細胞（embryonal carcinoma cell，EC細胞）；二.從囊胚的內(nèi)細胞團建立的胚胎干細胞（embryonic stem cell，ES細胞）；三.從胚胎性腺區(qū)的原始生殖細胞建立的胚胎生殖細胞（embryonic germ cell，EG細胞）。胚胎干細胞的多能性主要依靠以O(shè)ct

2、4，Nanog，Sox2為核心的轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)來維持。
　　本文主要以P19胚胎癌細胞（EC細胞）為模型，研究干細胞在維甲酸（retinoic acid, RA）誘導(dǎo)的分化過程中的基因表達調(diào)控機制。P19細胞具有多能性，注射到囊胚期胚胎中能形成嵌合體動物、注射到裸鼠皮下能形成具有三胚層結(jié)構(gòu)的畸胎瘤；在體外，能被誘導(dǎo)分化成胚胎所有三胚層來源的細胞。因此，P19細胞是研究多能干細胞分化調(diào)控機制的良好模型。
　　本文著重研究轉(zhuǎn)錄因子

3、FoxA1在干細胞分化過程中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。FoxA1是Forkhead Box轉(zhuǎn)錄因子家族的一員，參與胚胎發(fā)育中細胞增殖與分化的調(diào)節(jié)。由于能夠結(jié)合高度壓縮的染色質(zhì)，并引導(dǎo)其它轉(zhuǎn)錄因子與染色質(zhì)的結(jié)合，F(xiàn)oxA1被稱為“先鋒”轉(zhuǎn)錄因子。過去的研究發(fā)現(xiàn)，在RA誘導(dǎo)的P19細胞分化過程中，F(xiàn)oxA1表達迅速被激活；多能性相關(guān)基因表達迅速下降，如Nanog；而分化相關(guān)基因表達依次被激活，如早期神經(jīng)發(fā)生相關(guān)基因Shh，神經(jīng)干細胞標志物Nestin

4、。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxA1直接激活了Shh的表達；同時發(fā)現(xiàn)，在P19細胞中單獨過表達FoxA1，可激活Nestin表達，并導(dǎo)致Nanog蛋白水平的下降。本文從表觀遺傳學(xué)角度，探索轉(zhuǎn)錄因子FoxA1在RA誘導(dǎo)的干細胞分化過程中對多能性基因Nanog的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，并得到了以下結(jié)果：
　　一.檢測了RA誘導(dǎo)前后多能性標志基因Nanog的表達水平及表觀遺傳修飾狀態(tài)的變化。RA處理P19細胞后， Nanog的mRNA及蛋白水平均迅速下調(diào)；

5、同時，我們考察了表觀遺傳修飾狀態(tài)包括組蛋白H3乙?；℉3K9ac）修飾、組蛋白H3K4甲基化(H3K4me2)修飾、組蛋白H3K27(H3K27me3)甲基化修飾和DNA甲基化修飾。研究發(fā)現(xiàn)，在未分化狀態(tài)， Nanog基因的組蛋白修飾狀態(tài)表現(xiàn)為H3K9高度乙?；?，H3K4高度甲基化，H3K27低甲基化；RA誘導(dǎo)兩天后，H3K9被去乙?；?，H3K4甲基化程度降低， H3K27高度甲基化。DNA甲基化方面，在未分化的P19細胞中，Nano

6、g啟動子區(qū)域呈現(xiàn)低甲基化；RA處理四天后，Nanog啟動子區(qū)域被高度甲基化。
　　二.發(fā)現(xiàn)在RA誘導(dǎo)過程中，F(xiàn)oxA1和Grg3直接結(jié)合于Nanog基因的增強子，并抑制Nanog的表達。根據(jù)過去的研究結(jié)果，猜測FoxA1直接抑制Nanog基因的表達。有文獻報道FoxA1可能募集轉(zhuǎn)錄輔抑制子Grg3，通過mRNA和蛋白水平檢測，發(fā)現(xiàn)，在RA誘導(dǎo)前后的P19細胞中，Grg3保持穩(wěn)定表達。通過染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實驗，確認，在RA

7、處理兩天時FoxA1與Grg3同時結(jié)合于Nanog基因上游-2kb附近區(qū)域。此外，在RA處理P19細胞時，分別干擾FoxA1和Grg3的表達，發(fā)現(xiàn)RA處理兩天后， Nanog仍然維持表達。
　　三.探索了FoxA1抑制Nanog表達的細節(jié)分子機制。通過凝膠遷移實驗（EMSA）確認FoxA1結(jié)合Nanog增強子-2025bp至-2001bp區(qū)域，而Grg3單獨不能結(jié)合DNA；通過免疫共沉淀（Co-IP）與免疫熒光共定位實驗，確認了F