HBxAg對S100A11的轉(zhuǎn)錄調(diào)控及S100A11對肝癌BEL-7402細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是慢性肝炎的重要病原之一，常導(dǎo)致嚴(yán)重肝病，包括肝硬化和肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcmoma，HCC)。在HCC形成過程中，其中HBxAg(hepatitis B x antigen)的功能一直是研究熱。在轉(zhuǎn)錄水平HBxAg對病毒本身及人類多種基因具有激活及阻遏作用。S100A11蛋白廣泛存在于正常人體組織細(xì)胞中，該蛋白進入細(xì)胞核發(fā)揮細(xì)胞生長負(fù)調(diào)節(jié)作用。在某些腫

2、瘤細(xì)胞中S100A11蛋白的表達量升高。而增多的S100A11蛋白從腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核移位至細(xì)胞質(zhì)?！坝郎奔?xì)胞中的這種蛋白定位改變可能使其喪失本身的生物學(xué)功能。 目的： 本課題旨在研究S100A11蛋白在肝癌細(xì)胞系BEL-7402增殖過程中發(fā)揮的作用，以及明確該蛋白在正常肝細(xì)胞、慢性HBV感染的肝細(xì)胞及肝癌細(xì)胞中的核質(zhì)定位分布特點，進一步探討HBxAg對S100A11基因在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)作用。 方法：

3、1．構(gòu)建S100A11的真核表達載體(實驗組)，同時設(shè)平行對照，轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系BEL-7402，篩選穩(wěn)定表達。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測肝癌細(xì)胞BEL-7402中處于細(xì)胞分裂各周期中的相對細(xì)胞數(shù)，分析含目的基因質(zhì)粒組及相應(yīng)對照組中處于分裂周期中S期的細(xì)胞數(shù)。采用活細(xì)胞發(fā)光法檢測兩組細(xì)胞中活細(xì)胞數(shù)量相對值，繪制細(xì)胞生長曲線并進行比較。 2．構(gòu)建HBxAg的真核表達載體及S100A11-promoter熒光素報告質(zhì)粒，并設(shè)平行對照，轉(zhuǎn)染BE

4、L-7402。制備轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞裂解液，在肝癌BEL-7402細(xì)胞中檢測HBxAg對S100A11啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響。用Luciferase法檢測報告基因表達。 3．通過免疫組織化學(xué)技術(shù)比較S100A11蛋白在正常肝細(xì)胞、慢性HBV感染的肝細(xì)胞以及肝癌細(xì)胞中的分布情況。構(gòu)建S100A11綠色熒光素質(zhì)粒，瞬時轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系BEL-7402，通過熒光顯微鏡觀察融合蛋白在BEL-7402中的分布。 結(jié)果： 1．實驗組B

5、EL-7402細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測后發(fā)現(xiàn)處于S期的細(xì)胞占26.49±1.94％；而平行對照組中處于S期的細(xì)胞占30.42±1.62％；野生株BEL-7402中處于細(xì)胞分裂周期中S期的細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的31.40±2.06％。均分細(xì)胞后，用活細(xì)胞發(fā)光法檢測細(xì)胞增殖情況。 結(jié)果顯示，36h檢測時實驗組細(xì)胞增殖速率與對照組相比明顯降低。 2．本實驗成功獲得含人S100A11基因啟動子的熒光素報告載體，且測序證實插入序列與理論序列

6、一致。實驗組的轉(zhuǎn)錄活性與對照組的轉(zhuǎn)錄活性相比降低60％。 3．免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞胞質(zhì)中S100A11蛋白的量較正常細(xì)胞明顯增多，慢性乙型肝炎中S100A11蛋白的表達量微弱。而我們強制表達的外源性S100A11蛋白在BEL-7402細(xì)胞的細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中均有分布。 結(jié)論： 1．S100A11對肝癌細(xì)胞BEL-7402具有明顯的生長抑制作用，主要表現(xiàn)為使處于細(xì)胞分裂周期中S期細(xì)胞數(shù)量明顯減少。