小鼠N5-谷氨酰胺甲基轉(zhuǎn)移酶基因mHemk的進(jìn)一步研究.pdf

1、簡介：甲基化是細(xì)胞內(nèi)一種普遍且重要的表觀遺傳修飾機(jī)制，它通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)或蛋白翻譯來調(diào)節(jié)重要的細(xì)胞或新陳代謝的過程。S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）是體內(nèi)普遍存在的甲基供體。SAM-依賴的甲基轉(zhuǎn)移酶屬于一個大的普遍存在的酶家族，這個酶家族可以將甲基從SAM上轉(zhuǎn)移到各種底物上，如核酸（DNA或RNA）、蛋白質(zhì)以及很多小分子物質(zhì)。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶和蛋白質(zhì)甲基轉(zhuǎn)移酶是最重要和最普遍的甲基化酶，而且已經(jīng)展開了廣泛地研究。由甲基轉(zhuǎn)移酶調(diào)控的DNA

2、轉(zhuǎn)錄后甲基化和蛋白質(zhì)翻譯后甲基化是引起上述底物分子發(fā)生表觀遺傳學(xué)改變的機(jī)制。這些表觀遺傳學(xué)的改變能改變基因表達(dá)的標(biāo)靶和時間以及某些蛋白質(zhì)的活性。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶不僅在維持DNA甲基化和基因組穩(wěn)定性方面起重要作用，而且哺乳動物早期胚胎發(fā)育中也具有重要作用。在細(xì)菌、原生生物和植物DNA中發(fā)現(xiàn)了三種甲基化堿基，分別為5-甲基胞嘧啶（m5C）、N6-甲基腺嘌呤（m6A）、N4-甲基胞嘧啶（m4C），而在哺乳動物DNA中只發(fā)現(xiàn)了5-甲基胞嘧啶（m

3、5C）。蛋白質(zhì)甲基化是蛋白質(zhì)的一種翻譯后修飾方式，它能夠調(diào)節(jié)靶蛋白分子或分子間的相互作用。目前對精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶和賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的研究比較多，它們與組蛋白甲基化有關(guān)，同時它們在基因轉(zhuǎn)錄中起到很重要的調(diào)節(jié)作用。此外，在細(xì)菌和酵母中證實(shí)到含有N5-谷氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，這種酶與肽鏈釋放因子（RFs）的甲基化有關(guān)，而且在蛋白質(zhì)的翻譯中起到重要作用。 ESTs在未分化的人類胚胎干細(xì)胞中高表達(dá)，以ESTs為起點(diǎn)并在鼠的dbEST數(shù)據(jù)庫中使用

4、同源分析，本研究預(yù)先克隆了一個新的假定的小鼠N5-谷氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因的兩個轉(zhuǎn)錄本，并分別命名為mHemk2和mHemk2（Genbank錄入編號分別為AY456393和AY583759）。長轉(zhuǎn)錄本mHemk1長1792bp，編碼一個由214個氨基酸殘基組成的23kDa小鼠蛋白。在蛋白數(shù)據(jù)庫的注釋中，由于在Hemk蛋白中存在S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）結(jié)合基序和一個NPPY基序，因此，在蛋白庫的說明中已經(jīng)將Hemk蛋白歸類于能甲基化

5、DNA中N6-腺嘌呤或N4-胞嘧啶的甲基轉(zhuǎn)移酶。這些基序被認(rèn)為是這種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的標(biāo)志。雖然mHemk兩個轉(zhuǎn)錄本所編碼的蛋白其亞細(xì)胞定位均為核質(zhì)都有且主要定位于細(xì)胞核，但至今在這兩個蛋白質(zhì)中都未曾檢測到任何DNA甲基化酶活性，這些都表明mHemk蛋白不是一個DNA甲基轉(zhuǎn)移酶。相反，細(xì)菌中的mHemk同源蛋白Hemk和酵母中的mHemk同源蛋白YDR140W都已經(jīng)被證實(shí)是Hemk甲基轉(zhuǎn)移酶家族的成員，它們都是蛋白質(zhì)甲基轉(zhuǎn)移酶，分別催化

6、以SAM作為甲基供體的酵母肽鏈釋放因子1（eRF1）及細(xì)菌肽鏈釋放因子1（RF1）和細(xì)菌肽鏈釋放因子2（RF2）的甲基化，這表明它們都是N5-谷氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶。雖然所有這些Hemk同源蛋白都沒有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性，但目前發(fā)現(xiàn)在Hemk蛋白中都含有N6-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的NPPY表征基序。我們過去的研究表明mHemk的mRNA在未分化的胚胎干細(xì)胞、睪丸和腦組織中高表達(dá)，在分化了的胚胎干細(xì)胞和腎臟組織中低表達(dá)，在肌肉、心臟、胎盤、胰臟、肺

7、和胃組織中不表達(dá)，同時也表明了由siRNA引起的mHemk蛋白表達(dá)的降低導(dǎo)致了蛋白翻譯和細(xì)胞增殖的減少。但mHemk蛋白是否是一個N5-谷氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶仍有待進(jìn)一步的證實(shí)。第一部分： 目的：研究mHemk蛋白的亞細(xì)胞定位以期發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證新的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜定位信號。 方法：在本研究中，以本實(shí)驗(yàn)室克隆并初步鑒定的一個新的小鼠N5-谷氨酰胺甲基轉(zhuǎn)移酶基因mHemk的兩個轉(zhuǎn)錄剪接本mHemk1和mHemk2（GenBank編號分別為A

8、Y456393和AY583759）為材料，進(jìn)一步分析了該蛋白的亞細(xì)胞定位。根據(jù)生物信息學(xué)的預(yù)測，在這兩個蛋白質(zhì)C-末端可能分別存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜定位信號RFSK和KSLK，且這兩個蛋白質(zhì)都可能主要定位于細(xì)胞質(zhì)。本研究分別構(gòu)建了這兩個蛋白質(zhì)以及相應(yīng)的刪除了C-末端RFSK和KSLK的缺失突變體與加強(qiáng)型綠色熒光蛋白的融合蛋白的表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染到MCF-7和Hela細(xì)胞中，用免疫熒光法觀測上述蛋白在這兩種細(xì)胞中的分布。 結(jié)果：融合蛋白EGF

9、P-mHemk1主要定位于細(xì)胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，相反，融合蛋白EGFP-mHemk1-M主要定位于細(xì)胞核。融合蛋白EGFP-mHemK2和EGFP-mHemK2-M在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中都有分布。 結(jié)論：mHemk1蛋白中的RFSK基序是一個新的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜定位信號，但沒有足夠的證據(jù)支持KSLK基序是mHemk2蛋白的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜定位信號。 第二部分： 目的：構(gòu)建小鼠N5-谷氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因mHemk的人類同源基因hHemk1

10、的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，并使含有mHemk基因和hHemk1基因編碼的蛋白在Sf9昆蟲細(xì)胞中表達(dá)，為功能和構(gòu)研究提供目的蛋白。 方法：將小鼠N5-谷氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因mHemk的人類同源基因hHemk1插入pFastBac-HT-A載體中構(gòu)建成重組桿粒pFastBac-HT-A/hHemk1，然后將新構(gòu)建的重組桿粒pFastBac-HT-A/hHemk1和已有的重組桿粒pFastBac-HT-A/mHemk1、pFastBac-HT

11、-A/m Hemk2轉(zhuǎn)染到Sf9昆蟲細(xì)胞中，收集相應(yīng)的桿狀病毒后，再用病毒感染正常的Sf9昆蟲細(xì)胞，提取總蛋白，最后用Western Blot檢測。 結(jié)果：通過PCR檢測到插入了hHemk1基因的陽性重組桿粒pFastBac-HT-A/hHemk1， 同時收集到了重組桿粒pFastBac-HT-A/m Hemk1、pFastBac-HT-A/mHemk2和pFastBac-HT-A/hHemk1轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞后產(chǎn)生的桿狀病

12、毒。通過Western Blot檢測桿狀病毒感染后的Sf9昆蟲細(xì)胞總蛋白，結(jié)果顯示mHemk1蛋白和hHemk1蛋白在Sf9昆蟲細(xì)胞中有表達(dá)，但mHemk2蛋白則未檢測到在Sf9昆蟲細(xì)胞中有表達(dá)。 結(jié)論：從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，初步肯定已經(jīng)得到了m Hemk1和hHemk1基因的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)并在Sf9昆蟲細(xì)胞中成功表達(dá)。 第三部分： 目的：研究mHemk蛋白的亞細(xì)胞定位以期發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證新的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜定位信號。 方

13、法：在本研究中，以本實(shí)驗(yàn)室克隆并初步鑒定的一個新的小鼠N5-谷氨酰胺甲基轉(zhuǎn)移酶基因mHemk的兩個轉(zhuǎn)錄剪接本mHemk1和mHemk2（GenBank編號分別為AY456393和AY583759）為材料，進(jìn)一步分析了該蛋白的亞細(xì)胞定位。根據(jù)生物信息學(xué)的預(yù)測，在這兩個蛋白質(zhì)C-末端可能分別存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜定位信號RFSK和KSLK，且這兩個蛋白質(zhì)都可能主要定位于細(xì)胞質(zhì)。本研究分別構(gòu)建了這兩個蛋白質(zhì)以及相應(yīng)的刪除了C-末端RFSK和KSLK的缺

14、失突變體與加強(qiáng)型綠色熒光蛋白的融合蛋白的表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染到MCF-7和Hela細(xì)胞中，用免疫熒光法觀測上述蛋白在這兩種細(xì)胞中的分布。 結(jié)果：融合蛋白EGFP-mHemk1主要定位于細(xì)胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，相反，融合蛋白EGFP-mHemk1-M主要定位于細(xì)胞核。融合蛋白EGFP-mHemK2和EGFP-mHemK2-M在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中都有分布。 結(jié)論：mHemk1蛋白中的RFSK基序是一個新的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜定位信號，但沒有足夠的證

15、據(jù)支持KSLK基序是mHemk2蛋白的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜定位信號。 第四部分： 目的：構(gòu)建小鼠N5-谷氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因mHemk的人類同源基因hHemk1的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，并使含有mHemk基因和hHemk1基因編碼的蛋白在Sf9昆蟲細(xì)胞中表達(dá)，為功能和構(gòu)研究提供目的蛋白。 方法：將小鼠N5-谷氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因Hemk的人類同源基因hHemk1插入pFastBac-HT-A載體中構(gòu)建成重組桿粒pFastBac-HT-

16、A/hHemk1，然后將新構(gòu)建的重組桿粒pFastBac-HT-A/hHemk1和已有的重組桿粒pFastBac-HT-A/mHemk1、pFastBac-HT-A/mHemk2轉(zhuǎn)染到Sf9昆蟲細(xì)胞中，收集相應(yīng)的桿狀病毒后，再用病毒感染正常的Sf9昆蟲細(xì)胞，提取總蛋白，最后用Western Blot檢測。 結(jié)果：通過PCR檢測到插入了hHemk1基因的陽性重組桿粒pFastBac-HT-A/hHemk1，同時收集到了重組桿粒pF

17、astBac-HT-A/m Hemk1、pFastBac-HT-A/mHemk2和pFastBac-HT-A/hHemk1轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞后產(chǎn)生的桿狀病毒。通過Western Blot檢測桿狀病毒感染后的Sf9昆蟲細(xì)胞總蛋白，結(jié)果顯示mHemk1蛋白和hHemk1蛋白在Sf9昆蟲細(xì)胞中有表達(dá)，但mHemk2蛋白則未檢測到在Sf9昆蟲細(xì)胞中有表達(dá)。 結(jié)論：從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，初步肯定已經(jīng)得到了mHemk1和hHemk1基因的桿狀病毒