抗尼克酰胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶（NNMT）單克隆抗體的制備與生物學(xué)特性鑒定.pdf

1、尼克酰胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶(NNMT)是催化藥物、異型生物質(zhì)甲基化的一種S-腺苷蛋氨酸依賴(lài)性胞質(zhì)酶，主要分布于肝臟，在體內(nèi)主要催化尼克酰胺。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，帕金森綜合癥(PD)病人腦組織中NNMT表達(dá)明顯增高。PD患者的腦脊液中NNMT含量也顯著增高，其含量明顯受到年齡的影響，會(huì)隨患者年齡增加而降低?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中NNMT過(guò)量可能是帕金森綜合癥發(fā)病機(jī)制之一。有學(xué)者檢測(cè)了腎癌和正常腎組織的基因表達(dá)框架后發(fā)現(xiàn)透明細(xì)胞型腎癌，嫌色

2、細(xì)胞型腎癌和正常腎組織均有獨(dú)特的基因表達(dá)框架，NNMT表達(dá)水平在透明細(xì)胞癌中比后兩者高出三倍多。而且在透明細(xì)胞型腎癌中NNMTmRNA水平也顯著增高。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，編碼NNMT的基因在乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞株中高表達(dá)。同時(shí)對(duì)人類(lèi)甲狀腺標(biāo)本NNMT進(jìn)行免疫組化染色后發(fā)現(xiàn)，在乳頭狀甲狀腺癌區(qū)域免疫組化顯示胞漿反應(yīng)強(qiáng)陽(yáng)性。另有學(xué)者檢測(cè)了放療抵抗性膀胱癌細(xì)胞株及放療敏感性亞克隆中的DNA修復(fù)基因后發(fā)現(xiàn)，膀胱癌放療敏感性克隆中NNMT表達(dá)會(huì)下調(diào)。因此

3、，NNMT可能成為輔助診斷帕金森綜合癥、透明細(xì)胞型腎癌、乳頭狀甲狀腺癌及區(qū)分膀胱癌是否為放療敏感性的一個(gè)生物標(biāo)志。 制備N(xiāo)NMT的單克隆抗體為建立免疫學(xué)檢測(cè)方法檢測(cè)幾種疾病血液、體液中的NNMT蛋白含量作了必要的準(zhǔn)備，還可將其應(yīng)用免疫組化技術(shù)分析各種組織中NNMT的表達(dá)，這將對(duì)腎癌等疾病在亞型診斷及疾病預(yù)后方面有很大的幫助。目的：研制抗尼克酰胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶(NNMT)單克隆抗體，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定.方法：采用B淋巴細(xì)胞

4、雜交瘤技術(shù)，以NNMT-GST融合蛋白及NNMT蛋白為抗原，免疫BALB/C小鼠，取小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0經(jīng)PEG融合，在HAT選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用間接ELISA方法鑒定陽(yáng)性克隆，用有限稀釋法使陽(yáng)性雜交瘤進(jìn)一步克隆化篩選出陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株。以動(dòng)物體內(nèi)誘生獲得腹水的方法制備抗體，用辛酸-硫酸銨提取法純化腹水獲得純品抗體，并通過(guò)凝膠掃描分析其純度。用HyCultbiotechnology鼠單抗定型試劑盒鑒定抗體的亞型及輕鏈型；用W

5、estern-blot法檢測(cè)單克隆抗體的特異性；用間接ELISA方法測(cè)定抗體的滴度并進(jìn)行相對(duì)親和力分析；用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)正常肝臟組織及透明細(xì)胞型腎癌組織、乳頭狀甲狀腺癌組織中NNMT的表達(dá)。結(jié)果：獲得了兩株(2F8、1E7)能穩(wěn)定分泌抗NNMT的雜交瘤細(xì)胞株。收集腹水后制備的純品抗體滴度及純度較高，2F8株抗體效價(jià)達(dá)1∶51200，純度為85.6％；1E7株抗體效價(jià)達(dá)1∶12800，純度為90.2％。Western-blot法證實(shí)兩

6、株細(xì)胞分泌的抗體均有高度特異性。2F8及1E7兩株細(xì)胞分泌抗體的亞型分別為IgG2bκ和IgG2aκ。比較兩株細(xì)胞分泌抗體的相對(duì)親和力為2F8＞1E7。免疫組化結(jié)果顯示，正常肝臟組織及透明細(xì)胞型腎癌組織、乳頭狀甲狀腺癌組織中NNMT均顯陽(yáng)性表達(dá)，而正常腎臟組織及甲狀腺組織中顯陰性。結(jié)論：成功地研制了抗人NNMT的單克隆抗體細(xì)胞株，并制備出了單克隆抗體，同時(shí)用Western-blot、免疫組化等方法鑒定了其生物學(xué)特性。鑒定結(jié)果表明所獲單抗